Heightened Characterization of AAVs by SEC-MALS with XBridge Premier GTx BEH SEC 450 Å 2.5 μm Columns

Význam tématu

Charakterizace adeno-asociovaných vektorů (AAV) je klíčová pro vývoj bezpečných a účinných genových terapií. Znalost velikostního rozložení, agregace a poměru prázdných a plných částic rozhoduje o dávkování, imunogenicitě a kvalitě finálního léčiva.

Cíle a přehled studie

Cílem této studie bylo ověřit výkonnost SEC-MALS analytické metody s novými XBridge Premier GTx BEH SEC 450 Å 2,5 µm kolónami pro detailní biofyzičkou analýzu AAV partikulí. Výzkum se zaměřil na rozlišení monomerů a agregátů, stanovení molární hmotnosti a poměru prázdných vs. plných kapsid.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorků byla použita 2× PBS pufrovaná sůl, standardní proteiny (BSA, BTG) a AAV sérum 2 a 9 v různých poměrech prázdných/plných kapsid.

• Kapalinová chromatografie: ACQUITY UPLC H-Class Bio
• Detekce: UV (280 nm), refrakční index, MALS (18 úhlů) a online DLS (QELS)
• Kolóny: XBridge Premier GTx BEH SEC 450 Å 2,5 µm (4,6×150 mm, 4,6×300 mm, 7,8×300 mm)
• Software: Empower Pro 3 pro akvizici dat a ASTRA 8 pro MALS/DLS analýzu
• Podmínky: isokratický režim, pufr 20 mM fosfát/276 mM NaCl/5,4 mM KCl pH 7,4, teplota kolóny 30 °C, tok 0,20 mL/min (4,6 mm) a 0,575 mL/min (7,8 mm)

Hlavní výsledky a diskuse

Kolóny s 450 Å póry a vysokou účinností balení (2,5 µm) umožnily vynikající rozlišení mezi monomery a různými agregáty BSA, BTG a AAV. MALS signál vykazoval nízký šum (<30 µV) i při nízkém průtoku, což zabezpečilo přesné stanovení molární hmotnosti (~3,7 MDa pro AAV monomer). Poměry Rg/Rh pro monomery AAV kolem 0,81 potvrzují téměř globulární tvar, zatímco vyšší agregáty vykazovaly mírně otevřenější konformaci. Porovnání kolón 4,6 mm a 7,8 mm id prokázalo srovnatelnou chromatografickou kvalitu, přičemž širší kolóna mírně zlepšila rozlišení.

Pomocí integrace UV, RI a MALS dat dokázala metoda kvantifikovat proteinovou a nukleovou hmotu zvlášť. Při míchání prázdných a plných AAV9 kapsid byl potvrzen lineární nárůst nukleové hmoty s koeficientem determinace R² = 0,9998, což demonstruje spolehlivé stanovení poměru prázdných vs. plných částic.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a bezkalibrační kvantifikace molární hmotnosti a velikosti AAV
• Citlivé rozlišení monomerů, agregátů a nízkomolekulárních nečistot
• Robustní měření poměru prázdných a plných kapsid bez nutnosti ELISA nebo qPCR
• Široká kompatibilita se standardními UPLC systémy a MALS detekcí

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšíření SEC-MALS metodiky pro nové AAV serotypy, optimalizaci víceatributových analýz a integraci s hyphenovanými technikami (např. LC–MS). Vývoj kolón s různou pórovitostí a povrchovými úpravami může zvýšit rozlišení a citlivost pro komplexní virové vektory.

Závěr

Studie potvrdila, že XBridge Premier GTx BEH SEC 450 Å 2,5 µm kolóny spojené s SEC-MALS představují výkonný nástroj pro detailní biofyzičkou charakterizaci AAV vektorů. Kombinace vysoké chromatografické účinnosti, nízkého šumu a multiatributové detekce umožňuje přesné a spolehlivé stanovení kritických parametrů genových terapií.

Reference

1. Fekete S., et al. Chromatographic Strategies for the Analytical Characterization of Adeno-Associated Virus Vector-Based Gene Therapy Products. TrAC Trends Anal. Chem., 2023, 164:117088.
2. DelveInsight Blog. AAV Vectors in Gene Therapy: How Recent Clinical Advances are Unraveling New Potentials? 2022.
3. Nature Biotechnology. High-dose AAV gene therapy deaths. 2020, 38(8):910.
4. Pradhan S., et al. Viral Aggregation: The Knowns and Unknowns. Viruses, 2022, 14(2).
5. McIntosh N.L., et al. Comprehensive Characterization and Quantification of Adeno Associated Vectors by Size Exclusion Chromatography and Multi Angle Light Scattering. Sci. Rep., 2021, 11:3012.
6. Wyatt Technology. Online MALS-QELS (Quasi-Elastic Light Scattering). AN7301.
7. Michelle Chen, A.P. Quantifying quality attributes of AAV gene therapy vectors by SEC-UV-MALS-dRI. Wyatt Technology. AN1617.
8. Tande B.M., et al. Viscosimetric, Hydrodynamic, and Conformational Properties of Dendrimers and Dendrons. Macromolecules, 2001, 34(24):8580–8585.