Automated and faster library-free dia-PASEF analysis with a Spectronaut integrated workflow in ProteoScape

Význam tématu

Rychlá a efektivní analýza proteomických dat je klíčová pro rozsáhlé studie založené na data-independent acquisition (DIA). Library-free přístupy, jako directDIA+, odstraňují nutnost vytváření spektrálních knihoven z DDA dat, avšak trpí delší dobou zpracování. Integrace real-time zpracování během akvizice přináší výhodu okamžité kontroly kvality a zkrácení celkového času do výsledků.

Cíle a přehled studie / článku

Studie se zaměřuje na implementaci Spectronaut directDIA+ workflow přímo v platformě Bruker ProteoScape (BPS) pro automatizovanou, rychlejší a bez-knihovní analýzu dia-PASEF dat. Cílem bylo:

• Porovnat časovou úsporu a výkonnost mezi integrovaným BPS a samostatnou verzí Spectronaut.
• Ověřit spolehlivost identifikace, kvantifikace a přesnosti na dvou testovacích datech: multi-species s definovanými poměry a obohaceném fosfoproteomickém datasetu.

Použitá metodika a instrumentace

Data byla získána na Bruker timsTOF (dia-PASEF) s chromatografií 45 min gradient + 15 min overhead. Pro zpracování:

• BPS integrované moduly: akvizice & real-time directDIA+ v ProteoScape (verze s modulem Spectronaut v18).
• Porovnání se samostatnou aplikací Spectronaut (standalone directDIA+).
• Testovací dataset 1: Human, Yeast a E.coli smíchané v poměrech 1:1 ; 1:2 ; 4:1 (5 replikací).
• Testovací dataset 2: fosforylačně obohacený vzorek (Skowronek et al., 2022; PXD034128) s 21min gradientem.

Hlavní výsledky a diskuse

Časová efektivita:

• BPS pipeline zpracovala data o ~2,5 hodiny rychleji (~40 %) než tradiční workflow vyžadující převod a spuštění analýzy až po skončení akvizice.

Komparativní výkon:

• Identifikace proteinových skupin, bílkovin, prekurzorů a peptidů byly srovnatelné mezi integrovanou a samostatnou verzí.
• Kvantifikační přesnost a reprodukovatelnost (CV) nevykázaly významné rozdíly.
• V fosfoproteomickém datasetu byla zjištěna > 90 % shoda identifikovaných fosfopeptidů a srovnatelná lokalizační jistota PTM (filtr 0,75).
• Při porovnání s hluboce frakcionovanou spektrální knihovnou byla shoda nižší, což naznačuje prostor pro další optimalizaci library-free přístupů.

Přínosy a praktické využití metody

• Automatizované zpracování zrychluje dobu do výsledků, umožňuje včasné rozhodování o opakované injekci vzorku.
• Uživatelé mohou okamžitě vyhodnocovat kvalitu jednotlivých běhů a spouštět projekčně-úrovňové slučování dat bez přerušení akvizičního běhu.
• Intuitivní grafické rozhraní BPS nabízí snadný přístup k detailním analýzám i exportům do standalone Spectronaut.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Dále zvyšovat paralelismus a rychlost zpracování v rámci BPS modulu.
• Rozšiřovat podporu dalších PTM workflow a strojového učení pro zvýšení citlivosti library-free analýz.
• Integrace cloudových řešení pro škálování na velké koherentní studijní kohorty.
• Propojování s dalšími 3rd-party algoritmy (DIA-NN, Novor) pro maximalizaci flexibility a výkonnosti.

Závěr

Integrace Spectronaut directDIA+ do Bruker ProteoScape významně zkracuje dobu zpracování dia-PASEF dat při zachování vysoké kvality identifikace a kvantifikace. Real-time workflow přináší výhody okamžité kontroly kvality a efektivního řízení proteomických projektů.

Reference

• Skowronek et al., 2022; PXD034128