Comparison of different processing pipelines for dia PASEF ® data

Význam tématu

Analytické metody založené na dia-PASEF přinášejí zvýšenou účinnost detekce a selektivitu díky kombinaci data independent acquisition a iontové mobility. Použití kolizního průřezu molekul jako čtvrté analytické dimenze zlepšuje úplnost a spolehlivost label-free kvantifikace, což je klíčové pro proteomické aplikace ve výzkumu i průmyslu.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo srovnat různé softwarové pipeline pro zpracování dia-PASEF dat a posoudit jejich vliv na identifikaci a kvantifikaci proteinových skupin z komplexních biologických směsí. Studie využila standardizované vzorky z Arabidopsis thaliana, Yarrowia lipolytica a Streptomyces coelicolor v definovaných poměrech.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky byly připraveny digesí trypsinem a smíchány v poměru 0.33/1.5/1. Pro generování knihoven bylo použito osm frakcí připravených s Pierce kit. Separace proběhla na nano-HPLC nanoElute (Bruker Daltonics) s 90min gradientem na 250 mm IonOpticks kolonce. Analýza byla provedena na timsTOF Pro (Bruker Daltonics) v režimu DDA PASEF a dia-PASEF. Pro zpracování dat byly využity tři přístupy:

• Mobi-DYK a OpenSwath v kombinaci s MaxQuant 1.6.6.0
• Spektronaut 14 (Pulsar) od Biognosys
• PEAKS Studio X+
• Alternativně Direct-DIA v Spectronaut

Hlavní výsledky a diskuse

Všechny pipeline úspěšně podporují tvorbu CCS-aware knihoven s více než 10 000 proteinovými skupinami a až 90 000 unikátními peptidy při FDR 1 %. Knihovny generované pomocí PEAKS a Spectronaut měly nejvyšší počty detekovaných proteinů. Obnovení knihovny ve 90min gradientu překročilo 70 % pro všechny přístupy, Direct-DIA dosáhla minimálně 55 %. Kvantitativní poměry mezi složkami směsí byly ve všech případech věrně reprodukovány, přičemž rozdíly mezi softwarovými variantami byly minimální.

Přínosy a praktické využití metody

• Podpora čtvrté analytické dimenze (iontová mobilita) zvyšuje selektivitu a citlivost detekce.
• CCS-aware knihovny zlepšují identifikaci a kvantifikaci v label-free experimentech.
• Metoda dia-PASEF je kompatibilní s volně dostupnými i komerčními softwarovými řešeními.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další zlepšení výkonu softwarových nástrojů včetně integrace nových verzí MaxQuant do Mobi-DYK/OpenSwath workflow. Rozvoj umělé inteligence a strojového učení pro zpracování dia-PASEF dat zvýší automatizaci a citlivost analýz. Možnosti aplikací sahají od klinické proteomiky až po průmyslovou kontrolu kvality biotechnologických výrobků.

Závěr

Srovnání různých zpracovatelských pipeline pro dia-PASEF data potvrdilo vysokou kompatibilitu a robustnost všech přístupů. Ion-mobility rozměr a CCS-aware knihovny přinášejí významné zlepšení v kvalitě identifikace i kvantifikace proteomů. Výsledky podporují širší adopci dia-PASEF ve vědeckých i aplikovaných proteomických laboratořích.

Reference

• Chapelle M. et al. Comparison of different processing pipelines for dia-PASEF data, 2019
• Henry C. et al. AgroParisTech, Micalis Institute, 2019
• Kasper S. et al. Bruker Daltonik GmbH, 2019