High throughput proteomics Application of dia PASEF and Evosep One for short gradients

Význam tématu

Data-independent acquisition (DIA) kombinovaná s iontovou mobilitou umožňuje vysoce reprodukovatelné a kvantitativní analýzy komplexních proteomických vzorků. Implementace krátkých LC gradientů na systému Evosep One významně zvyšuje propustnost laboratoře a zachovává široké pokrytí proteomu.

Cíle a přehled studie

Cílem prezentované studie bylo ověřit výkon dia-PASEF režimu na mass spektrometru timsTOF Pro v kombinaci se systémem Evosep One při čtyřech rychlých metodách (60, 100, 200 a 300 samples per day) na modelovém vzorku HeLa digest. Studie dále hodnotí využití hybridních spektrálních knihoven pro udržení přesnosti datové extrakce.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorek: in-house tryptický digest HeLa buněk
• LC systém: Evosep One s metodami 60, 100, 200 a 300 SPD
• Mass spektrometr: timsTOF Pro (Bruker Daltonics) s trapped ion mobility (TIMS) a quadrupole TOF
• dia-PASEF schéma: 1 MS scan (100 ms) + 24 dia fragmentačních oken (25 Da) v rozsahu m/z 400–1000, cyklus 900 ms
• Data processing: Spectronaut 14 (Biognosys) s tvorbou resource-specific a project-specific knihoven a jejich sloučením do hybridní knihovny

Hlavní výsledky a diskuse

• Metoda 60 SPD: průměrně 5 204 proteinových skupin a 39 936 peptidových sekvencí při 1 % FDR, dynamický rozsah ~5 řádů, medián CV 8,2 % (peptidy) a 5,9 % (proteiny)
• 100 a 200 SPD: mírný pokles identifikací při zachování přesné retence díky hybridní knihovně
• 300 SPD (3 min gradient, 5 min běh): identifikace přes 2 100 proteinových skupin a 10 462 peptidů v průměru
• Obrázek 1 (workflow): ukazuje postup tvorby knihoven a extrakce dat z dia-PASEF
• Obrázek 2: graf průměrného počtu identifikací proteinů a peptidů pro různé gradienty demonstruje udržení proteomového pokrytí i při extrémně krátkých metodách

Přínosy a praktické využití metody

Prezentovaná platforma nabízí rychlé a reprodukovatelné analýzy proteomu s dostatečnou hloubkou pro aplikace v klinické proteomice, farmaceutickém výzkumu, biomarkerových scénářích a rutinní QA/QC.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další zkracování gradientů, optimalizace dia-PASEF schémat pro specifické typy vzorků, rozšíření spektrálních knihoven napříč biologickými matricemi a aplikace strojového učení pro zlepšení extrakce slabých signálů a identifikaci nízkohojných proteinů.

Závěr

Kombinace timsTOF Pro v režimu dia-PASEF a Evosep One představuje robustní řešení pro vysoce propustnou proteomiku. I při nejrychlejším nastavení (300 SPD) bylo dosaženo identifikace více než 2 000 proteinových skupin, čímž se otevírají nové možnosti pro rychlé proteomické studie.

Reference

1. Meier F. et al., Molecular & Cellular Proteomics 17(12):2534–2545, 2018
2. Meier F. et al., dia-PASEF development, 2019
3. Muntel J. et al., Molecular Omics 15:348–357, 2019