Protein sample preparation and quantitation for mass spectrometry

Význam tématu
Proteomika založená na hmotnostní spektrometrii (MS) je klíčová pro identifikaci a kvantifikaci proteinů i jejich modifikací v biologických vzorcích. Úspěch analýzy MS závisí zejména na kvalitě přípravy vzorku, efektivní separaci, obohacení nízce množných proteinů či peptidů a na správné volbě instrumentace a softwaru pro zpracování dat. Optimalizované workflow usnadňuje odhalení nízce exprimovaných cílů, třeba fosfoproteinů, a zvyšuje reprodukovatelnost měření.

Cíle a přehled studie / článku
Text shrnuje komplexní nabídku reagentů, spotřebního materiálu, kitů a instrumentů pro práci s proteiny a peptidy od stanovení koncentrace přes obohacení až po samotné spektrometrické měření. Představuje:

• metody lýzy a extrakce proteinů z buněk, biofluids a subcelulárních frakcí,
• postupy pro vypuzení interferujících složek (albumin, IgG),
• enrich­ment cílových proteinových podmnožin (fosfopeptidy, aktivované enzymy, interakční partneři),
• protoko­ly pro enzymatickou přípravu vzorku (in-gel, in-solution, různé proteázy),
• čistící a desalační techniky (dialýza, desalting, odstraňování detergentů, koncentrace),
• metody SDS-PAGE a barvení gelů,
• fosfoproteinová enrich­ment (Fe-IMAC, TiO2, magnetické TiO2) a frakcionace peptidů při vysokém pH,
• kvalitní LC-MS instrumentace (Orbitrap, triple quad) a SW (Proteome Discoverer, ProteinCenter aj.),

Použitá metodika a instrumentace

Použitá instrumentace

• Elektroforéza: NuPAGE Bis-Tris a Tris-acetát gely, Bolt Bis-Tris Plus, XCell SureLock tanky, DynaMag magnety.
• Chromatografie: EASY-nLC 1200, UltiMate 3000 RSLCnano, Acclaim PepMap a EASY-Spray kolony.
• MS přístroje: Orbitrap Q Exactive HF, Fusion Lumos, TSQ Quantiva, LTQ Velos, MALDI-TOF (Voyager-DE Pro).
• Automatizace: KingFisher Flex fritované magnetické extrakční systémy.

Hlavní výsledky a diskuse

• Pro separaci a obohacení proteinů byly validovány kity pro lýzu (Mass Spec Sample Prep, Mem-PER, subcelulární frakce), depleci albuminu/IgG, měření koncentrace (BCA, Micro BCA), inhibici proteáz/fosfatáz.
• Enrich­ment nízkomnožných proteinů a jejich komplexů zajistily IP kity (Protein A/G, streptavidin, Dynabeads), aktivační sondy (ActivX ATP, GTP, FP-probes) i crosslinkery (DSS, BS3, DSSO) pro analýzu interakcí.
• Příprava vzorku pro MS (in-gel/in-solution digests) včetně multiplexní TMT rel. kvantifikace proběhla pomocí ověřených proteáz (Trypsin Gold, Lys-C, Lys-N, Asp-N, Glu-C, chymotrypsin) a modifikačních protokolů (alkylace IAA, IAM, NEM; redukce TCEP, DTT; guanidination) s výbornými výtěžky a nízkou mírou chyb.
• Čištění vzorku (dialýza, Zeba® desalting, detergent removal, concentrators) optimalizovalo podmínky pro LC-MS a zabránilo zablokování aparatury.
• Pro fosfoproteomiku vedl oboustranný přístup IMAC Fe-NTA a TiO2 k doplňujícímu obohacení fosfopeptidů (až 5mg na kolonu; >90% selektivita). Kity High pH RP umožnily odfrakcionovat komplexní tryptické směsi pro hloubkovou sekvenci proteomu.

Přínosy a praktické využití metody

• Kompletní end-to-end řešení od lýzy až po identifikaci a kvantifikaci proteinů/fosfoproteinů.
• Modulární konstrukce kitů umožňuje přizpůsobení workflow specifickým požadavkům (vzorek, množství, cíl analýzy).
• Vysoká reprodukovatelnost, snadná automatizace a validované protokoly šetří čas a zdroje laboratoře.
• Zvýšená hloubka proteomu i nízkoabudantních cílových proteinů umožňuje detailní charakterizaci biologických procesů a farmakologických účinků.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozvoj MS-cleavable crosslinkerů (DSSO) a odpovídajících SW pro analýzu protein-protein interakcí in vivo.
• Integrované platformy pro přímou analýzu živých buněk či tkání s minimální přípravou (cut-and-shoot LS-MS).
• Pokročilé algoritmy strojového učení pro komplexní proteomické datasety, včetně identifikace vzácných PTM a variant.
• Nové formáty multiplexního značení pro rozšíření paralelní kvantifikace desítek až stovek vzorků.

Závěr
Kombinace optimalizovaných protokolů přípravy vzorku, speciálních kity pro enrich­ment a frakcionaci, výkonné LC-MS instrumentace a specializovaného softwaru umožňuje moderní proteomickou analýzu s vysokou hloubkou detekce a kvantitativními výsledky. Gernerické a flexibilní řešení zkracuje čas přípravy, zvyšuje reprodukovatelnost a kvantitativní přesnost, a otevírá nové možnosti ve výzkumu biologických procesů, biomarkerů a farmaceutických cílů.

Reference
1. Wisniewski JR et al. Nat Methods 6:359–360 (2009)
2. Berman MS et al. Proteomics 11:2931–2935 (2011)
3. Haas W et al. Mol Cell Proteomics 5(7):1326–1337 (2006)
4. XlinkX Software Development, Thermo Fisher Scientific, 2020