New tools for improved proteomics results

Význam tématu

Proteomika založená na hmotnostní spektrometrii je zásadní pro pochopení buněčných procesů, biomarkerů i farmaceutického vývoje. Kvalita výsledků velmi závisí na přípravě vzorku, přesné kvantifikaci proteinů a stabilní kalibraci MS přístrojů. Standardizované reagencie a ověřené postupy umožňují mezi­laboratorní srovnatelnost dat a šetří čas v rutinní i výzkumné praxi.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem textu je představit ucelenou řadu nových produktů Thermo Fisher Scientific pro proteomiku, zahrnující:

• kity pro rychlou a reprodukovatelnou přípravu proteinů (EasyPep MS Sample Prep),
• reagencie pro obohacení fosfopeptidů (High-Select Fe-NTA Magnetic Phosphopeptide Kit),
• moduly a standardy pro cílenou kvantifikaci proteinu a fosfoproteinu (SureQuant IP-MS, HeavyPeptide AQUA panely),
• rozšířenou multiplexní značkovací sadu TMTpro 18plex a super-heavy variantu pro 2D kvantifikaci,
• MS-rozložitelné a obohacovatelné crosslinkery pro zkoumání protein-protein interakcí,
• standardy pro kontrolu instrumentální výkonnosti (Peptide Retention Time Calibration, Yeast/HeLa Digest, Small Molecule Suitability, FlexMix).

Použitá metodika a instrumentace

Pracovní postupy zahrnují standardizovanou extrakci, redukci/alkylaci, tryptické štěpení a čistění peptidů před analýzou na nanoLC-MS/MS systémech. Pro cílené kvantifikace se využívá PRM/SRM nebo metod založených na spuštění signálem z trigger peptide (TOMAHAQ). Fosfopeptidy a crosslinkované peptidy se obohacují pomocí magnetických Fe-NTA nebo TiO2 matric.

Hlavní přístrojové platformy:

• Dionex UltiMate 3000 / EASY-nLC / Vanquish UHPLC systémy
• Orbitrap Exploris / Q Exactive HF / Orbitrap Eclipse / Orbitrap IQ-X / LTQ Orbitrap XL
• TSQ Quantis Triple Quadrupole
• KingFisher magnetické procesory

Hlavní výsledky a diskuse

Implementace EasyPep kitů zkrátila přípravu vzorků na 2–4 hodiny při udržení nebo zlepšení počtu identifikovaných proteinů a peptidů oproti tradičnímu workflow (>90 % peptidů bez chybějících štěpných míst). High-Select Fe-NTA obohacovací sady pro fosfopeptidy prokázaly selektivitu nad 90 % a umožnily identifikovat až tisíce fosfoproteinů. SureQuant moduly a HeavyPeptide AQUA panely dosáhly absolutní kvantifikace kaskád signálních cest (EGFR, RAS-MAPK, PI3K-AKT-mTOR) s fmoleární citlivostí. TMTpro 18plex rozšířilo multiplex na 18 vzorků bez kompromisu v identifikacích, přičemž Super Heavy varianta umožňuje 2D multiplexní cílené kvantifikace. MS-rozložitelné crosslinkery DSSO/DSBU a obohacovatelné PhoX/TBDSPP zefektivnily analýzu interakcí a struktur proteinových komplexů. Instrumentální standardy (PTC mix, Yeast, HeLa digest, small molecule a FlexMix) zabezpečily spolehlivé sledování citlivosti, linearity a přesnosti hmotnostního analyzátoru v celém rozsahu m/z.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšená reproducibilita a rychlost přípravy komplexních biologických vzorků
• Robustní multiplexní kvantifikace až 18 vzorků současně
• Citlivá detekce a přesné měření změn fosforylace v signálních drahách
• Efektivní identifikace protein–protein interakcí in vitro i in vivo
• Zavedení system suitability standardů vedoucí k pravidelné kontrole kvality LC-MS

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj MS-rozložitelných a obohacovatelných crosslinkerů s vyšší selektivitou pro in vivo aplikace, nové izobarické značkovací chemie pro ultra-multiplexing nad 18 kanálů a integrované workflow podporované umělou inteligencí pro automatizovanou analýzu dat. Také se rozšiřují možnosti hluboké proteomické analýzy malých objemů a single-cell proteomiky s ještě citlivějšími kalibracemi a standardy.

Závěr

Nové reagencie pro vzorkovou přípravu, kvantifikaci a kalibraci rozšiřují možnosti MS-based proteomiky směrem k rychlejším, robustnějším a vysoce multiplexním analýzám. Standardizované, ověřené postupy a reagencie významně přispívají ke snížení variability mezi experimenty i laboratořemi a současně rozšiřují paletu aplikací od fosfoproteomu až po protein–protein interakce.

Reference

• Krokhin O.V., Spicer V. Peptide retention standards and hydrophobicity indexes in reversed-phase high-performance liquid chromatography of peptides. Anal. Chem. 81(22):9522–9530 (2009).