Sample preparation for mass spectrometry

Význam tématu

V proteomických výzkumech je příprava vzorků rozhodujícím faktorem ovlivňujícím citlivost, správnou identifikaci a kvantifikaci proteinů a jejich modifikací. Optimalizované workflow zahrnující efektivní lýzu, depleci vysoce abundantních proteinů, digesti, obohacení fosfoproteinů/-peptidů a následné čištění umožňuje minimalizovat potlačení signálu méně abundantních komponent a poskytuje reprodukovatelné a vysoce kvalitní výsledky na hmotnostních spektrometrech.

Cíle a přehled studie / článku

Článek shrnuje ucelenou řadu produktů Thermo Scientific Pierce určených pro přípravu vzorků pro hmotnostní spektrometrii. Obsahuje postupy a zásobníky reaktivů pro:

• lýzu a extrakci proteinů z buněk a tkání
• depleci abundentních proteinů v biofluidech
• enzymatickou digestu (trypsin, Lys-C, LysN, Glu-C, Asp-N, chymotrypsin)
• obohacení fosfoproteinů/fosfopeptidů (Fe‐NTA, TiO₂, magnetické fazole)
• čistící kroky (desalting Zeba, C18 a grafitové kolony, odstraňování detergentů)

Použitá metodika a instrumentace

Workflow kombinuje:

• chemickou lýzu v detergentech a inhibitorech proteáz/fosfatáz
• imunoadsorpci a depleční kolonové systémy (albumin, IgG, Top12)
• enzymatickou digesti: MS-gradované proteázy (trypsin, Lys-C, LysN, Glu-C, Asp-N, chymotrypsin)
• obohacení fosfo‐subpopulací peptidů pomocí Fe‐NTA IMAC a titaniového oxidu (TiO₂) v tubusových či magnetických formátech
• čistící monolitické a mikrospinové C18 sorbenty, grafitové spin kolony a odstraňovače detergentů
• analytická měření LC-MS/MS na Orbitrap, Q Exactive, Ion Trap, MALDI‐TOF
• automatizační platformy KingFisher pro vysokopropustné zpracování

Hlavní výsledky a diskuse

Porovnání metod odhalilo:

• jedno‐stupňové depleční kolony Top2 a Top12 odstraní >95 % albuminu a IgG s výrazným zlepšením detekce nízce abundantních proteinů ve 2D gelech
• Pierce Mass Spec Sample Prep Kit pro kultivované buňky dosahuje >90 % redukce disulfidů a <10 % chybějících štěpení oproti konkurenci
• Fe‐NTA a TiO₂ obohacují komplementární podmnožiny fosfopeptidů s >50 % selektivitou a identifikují dvakrát až třikrát více modifikovaných sekvencí než bez enrichmentu
• grafitové kolony zachycují vysoce hydrfilní fosfopeptidy, které se ztrácejí na C18 fázích
• Detergent Removal Resin a spin desky odstraní >90 % SDS/CHAPS, zachovají >95 % protein/peptidů a obnovují identifikovatelnost ve spektrech

Přínosy a praktické využití metody

Implementace ucelených a validovaných přípravných souprav nabízí:

• zkrácení času přípravy vzorků a zvýšení propustnosti laboratoře
• vysoce reprodukovatelné výsledky mezi laboratořemi díky standardizovaným kitům
• zvýšení citlivosti a rozsahu detekce nízce abundantních proteinů a fosfomodifikovaných peptidů
• kompatibilitu s různými analytickými platformami a automatizačními systémy

Budoucí trendy a možnosti využití

Následující oblasti slibují další posun v proteomice:

• integrace s mikrofluidními a single‐cell proteomickými platformami
• vyspělé isobarické kvantitativní štítkování TMT/iTRAQ v kombinaci s multiprofily frmaci
• rozšíření aktivních sond pro cílené obohacení podskupin proteinů (kinázy, GTPázy, hydrolázy)
• vylepšené rutiny pro datovou analýzu a strojové učení pro hluboké profilování fosfoproteomu

Závěr

Pečlivě navržená, modulární workflow přípravy vzorků v kombinaci s MS-gradovanými reagensy a kitovými formáty významně zvyšuje efektivitu a kvalitu proteomických analýz. Eliminace ručních variací, zvýšení výtěžnosti a cílené obohacení podpopulací proteinů usnadňují průnik do komplexních biologických systémů a podporují nové objevy v biochemii a biomedicíně.

Reference

1. Wisniewski JR a kol. Nat. Methods 2009,6:359–60
2. Larsen MR a kol. Mol. Cell Proteomics 2005,4(7):873–86
3. Sugiyama N a kol. Mol. Cell Proteomics 2007,6:1103–9
4. Carrascal M a kol. J. Proteome Res. 2008,7(12):5167–76