Large Scale EasyPep MS Sample Preparation for Phosphopeptide Enrichment Workflows

Význam tématu

Phosphorylace je klíčová posttranslační modifikace regulující funkci proteinů a její studium na proteomové úrovni vyžaduje citlivé a reprodukovatelné postupy obohacení fosfopeptidů. Nízká hojnost fosforylovaných peptidů v komplexních vzorcích nutí k použití velkých množství proteinu a optimalizovanému workflow, aby bylo možné dosáhnout hluboké pokrytí fosfoproteomu.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavním cílem bylo ověřit škálovatelnost a výkonnost nového EasyPepTM vzorkovacího kitu pro přípravu peptidek a následné obohacení fosfopeptidů pomocí immobilizované metal-affinity chromatografie (IMAC) při práci s velkými proteiny (>1 mg). Studie porovnává velkoobjemový kolonový formát s klasickým spin formátem, hodnotí dobu zpracování a kompatibilitu s izobarickými TMT multiplexními značkami.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky buněčných extraktů (HeLa S3, A549) a lidské plazmy byly lysovány s inhibitorem fosfatáz, následovalo kombinované redukční/alkylační ošetření při 95 °C. Proteolýza probíhala trypsinem/Lys-C při poměru 1:25 (w:w). Peptidy byly očištěny pomocí centrifugačních spin nebo velkoobjemových kolon obsahujících až 100 mg pryskyřice a obohaceny IMAC kolonkami Fe-NTA. Multiplexní značení se provádělo pomocí Thermo Scientific TMT 11plex a TMTpro 16plex. Frakcionace proběhla vysokým pH reverzní fází. LC-MS analýzy byly realizovány na systému Thermo Scientific Dionex Ultimate 3000 Nano LC s 50 cm C18 EASY-Spray kolonou a kvadrupól-Orbitrap spektrometrech Q Exactive Plus a Orbitrap Fusion. Koncentrace proteinů a peptidů byly stanoveny BCA a kolorimetrickým peptidovým testem.

Hlavní výsledky a diskuse

• Velký kolonový formát EasyPep dosáhl srovnatelných výsledků s menším spin formátem v počtu identifikovaných proteinů, peptidů a fosfopeptidů.
• Workflow zkrátilo dobu vzorkové přípravy na 3–5 hodin, při zachování 95 % specifi cit fosfopeptidů a >80 % bezproblémového štěpení.
• Kompatibilita s různými typy vzorků (buněčné linie, plasm a tkáně) prokázala vysokou reprodukovatelnost a konzistenci identifikací.
• Multiplexní kvantitace s TMT 11plex a TMTpro 16plex ukázala srovnatelné výsledky pro proteiny a peptidy, avšak u TMTpro 16plex bylo identifikováno méně fosfopeptidů, což naznačuje potřebu další optimalizace.
• Citlivá detekce a kvantifikace EGFR fosfopeptidu potvrzuje aplikační potenciál pro studium buněčné signalizace a farmakodynamiky.

Přínosy a praktické využití metody

• Standardizované, rychlé a reprodukovatelné zpracování vzorků s nízkou mezi-laboratorní variabilitou.
• Flexibilita práce s malými (10–100 µg) i velkými (>1 mg) množstvími proteinu bez snížení výtěžku nebo kvality.
• Plná kompatibilita s izobarickými značkami TMT a TMTpro pro relativní kvantifikaci proteomu a fosfoproteomu.
• Vysoká specifi cité obohacení fosfopeptidů a konzistentní identifikace v komplexních biologických vzorcích.
• Možnost aplikace v základním výzkumu signalizace, hledání biomarkerů a vývoji terapeutických látek.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření platformy na další posttranslační modifikace (ubikvitinace, acetylace), zvýšení multiplexního rozlišení pomocí nových izobarických značek, integrace umělé inteligence pro optimalizaci datové analýzy a automatizace vzorkové přípravy pro vysokopropustné proteomické studie.

Závěr

EasyPepTM workflow představuje robustní a škálovatelný nástroj pro přípravu vzorků a obohacení fosfoproteomu ve velkém měřítku. Zkrácená doba přípravy, vysoká reprodukovatelnost a kompatibilita s moderními LC-MS systémy a izobarickými značkami z něj činí efektivní řešení pro pokročilé proteomické aplikace.

Reference

Původní text neobsahuje explicitní seznam literatury.