Sequential enrichment using metal oxide affinity chromatography (SMOAC) to enhance phosphoproteome coverage for quantitative proteomic analysis

Význam tématu

Phosphorylace proteinů je klíčová posttranslační modifikace, která ovlivňuje aktivitu, interakce a lokalizaci bílkovin v buňce. Detailní analýza fosfoproteomu umožňuje pochopit signalizační dráhy, odhalit mechanismy onemocnění a podpořit vývoj cílených terapií.

Cíle a přehled studie

Studie se zaměřila na optimalizaci sekvenčního obohacení fosfopeptidů z komplexních vzorků s cílem zvýšit pokrytí fosfoproteomu. Byly porovnány dvě strategie:

• SIMAC (nejprve IMAC, poté MOAC)
• SMOAC (nejprve MOAC, poté IMAC)

Kromě toho byla vyhodnocena vysokopH reverzní frakcionace a multiplexní kvantifikace pomocí TMT značení.

Použitá instrumentace

• Orbitrap Fusion Tribrid hmotnostní spektrometr
• High-Select TiO2 Phosphopeptide Enrichment Kit
• High-Select Fe-NTA Phosphopeptide Enrichment Kit
• High-pH Reversed-Phase Fractionation Kit
• Thermo Scientific Proteome Discoverer 2.2 se SEQUEST HT

Metodika

Proteiny z HeLa buněk byly štěpeny Lys-C a trypsinem. Peptidy prošly SMOAC obohacením (TiO2 následované Fe-NTA). Eluáty z obou stupňů byly vysušeny a frakcionovány při vysokém pH. Pro kvantifikaci byly vzorky označeny TMT10plex/TMT11-131C; následovala fázová extrakce, LC-MS analýza a bioinformatické zpracování.

Hlavní výsledky a diskuse

• Metoda SMOAC identifikovala o 21 % více unikátních fosfopeptidů než paralelní obohacení.
• High-pH frakcionace rozšířila počet identifikací na více než 32 500 fosfopeptidů.
• Multiplexní TMT analýza kvantifikovala téměř 24 000 fosfopeptidů s vysokou jistotou lokalizace.
• Odkryty byly nová místa fosforylace v Cdc25 rodině fosfatáz, klíčových regulátorech buněčného cyklu.

Přínosy a praktické využití metody

Sekvenční obohacení SMOAC ve spojení s frakcionací poskytuje hluboké pokrytí fosfoproteomu i při omezeném množství vzorku. Multiplexní TMT workflow zajišťuje přesnou a reprodukovatelnou kvantifikaci změn fosforylace napříč různými experimentálními podmínkami.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření obohacovacích technik o nové sorbenty pro zlepšení selektivity.
• Automatizace a integrace do high-throughput platforem pro klinické aplikace.
• Využití v personalizované medicíně k monitorování fosforylačních signatur onemocnění.

Závěr

Propojení SMOAC sekvenčního obohacení, vysokopH frakcionace a TMT multiplexní kvantifikace představuje výkonnou platformu pro komplexní analýzu fosfoproteomu s vysokým rozlišením, specifitou a reproducibilitou.

Reference

• Jensen SS, Larsen MR Rapid Commun Mass Spectrom 2007;15:3635-3645.
• Ficarro SB et al Nat Biotechnol 2002;20:301-305.
• Thingholm TT et al Mol Cell Proteomics 2008;7:661-671.
• Yang F et al Expert Rev Proteomics 2012;9:129-134.
• Erickson BK et al Anal Chem 2015;87:1241-1249.
• Hogrebe A et al Nat Commun 2018;9:1045.