An optimized enrichment strategy for improved mass spec analysis of chemically crosslinked peptides

Význam tématu

Cross-linking v kombinaci s hmotnostní spektrometrií umožňuje detailní mapování struktur proteinů a jejich vzájemných interakcí, což je klíčové pro pochopení biologických procesů a vývoj nových terapeutik.

Cíle a přehled studie / článku

Studie se zaměřuje na optimalizaci workflow přípravy vzorků pro analýzu crosslinkovaných peptidů pomocí acid-cleavable disuccinimidyl bis-sulfoxidu (aaDSBSO). Cílem bylo zvýšit identifikaci crosslinkovaných peptidů, zkrátit dobu protokolu a zlepšit čistotu obohacení.

Použitá metodika a instrumentace

V experimentu byly porovnány crosslinkery BS3, DSSO a aaDSBSO. Peptidy byly biotinylovány přes click-chemii (nejefektivnější reagent sDIBO), poté redukovány, alkylovány a štěpeny trypsinem/LysC. Enrichment probíhal na avidinových pryskyřicích (NeutrAvidin Plus Ultralink, Streptavidin POROS). Separace se uskutečnila na Thermo Scientific UltiMate 3000 UHPLC s EASY-Spray kolonkou a detekce na Orbitrap Fusion Tribrid MS. Data byla analyzována v Proteome Discoverer 2.2 s XlinkX modulem.

Hlavní výsledky a diskuse

aaDSBSO prokázal srovnatelnou účinnost crosslinkingu s DSSO, avšak o ~30 % nižší než BS3. Optimalizace acidního štěpení (5 % TFA, 4 h, 50 °C) vedla k maximálnímu odstranění biotinu a minimálním ztrátám peptidů. Nejlepší kapacitu a eluci vykázaly NeutrAvidin Plus Ultralink a Streptavidin POROS. Frakcionace SCX (100 mM NaCl, 4 % TEA) zvýšila identifikace o 14 % a snížila neoznačené peptidy o 33 %, reverzní fáze přinesla 50 % nárůst crosslinků. Celkový čas přípravy se zkrátil z 3,5 na méně než 2 dny (o 60 %). V komplexním HeLa matričním prostředí si workflow udrželo vysokou specificitu a výtěžnost.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlý workflow (≤2 dnů) oproti původním ~3,5 dnům
• Vyšší výtěžnost crosslinkovaných peptidů a snížení podílu neoznačených
• Vysoká specificita obohacení i v komplexních vzorcích
• Široké uplatnění v proteomických studiích interakcí a strukturálních analýzách

Budoucí trendy a možnosti využití

Perspektivou je rozšířit metodu na celoproteomové úrovni, využít nejnovější generace MS přístrojů, automatizovat přípravu vzorků, vyvíjet nové cleavable crosslinkery a integrovat kvantitativní přístupy pro mapování celých interaktomů.

Závěr

Optimalizovaný protokol s aaDSBSO přináší rychlejší, efektivnější a vysoce specifickou analýzu crosslinkovaných peptidů, což významně podpoří výzkum protein–proteinových interakcí a strukturální proteomiku.

Reference

1. Kao A, Chiu CL, Vellucci D, Yang Y, Patel VR, Guan S, Randall A, Baldi P, Rychnovsky SD, Huang L. Development of a novel cross-linking strategy for fast and accurate identification of cross-linked peptides of protein complexes. Mol Cell Proteomics. 2011;10(1):M110.002212.
2. Kaake RM, et al. A new in vivo cross-linking mass spectrometry platform to define protein-protein interactions in living cells. Mol Cell Proteomics. 2014;13(12):3533–3543.
3. Liu F, Rijkers D, Post H, Heck AJ. Proteome-wide profiling of protein assemblies by cross-linking mass spectrometry. Nat Methods. 2015;12(12):1179-84.