Optimized Sample Preparation for Phospho-Enrichable Crosslinkers

Význam tématu

Optimalizace přípravy vzorků pro fosfo-obohatitelná slučovací činidla (DSPP, TBDSPP) umožňuje zvýšit identifikaci nízce zastoupených propojovaných peptidů v komplexních biologických vzorcích. Tato metoda zlepšuje detailní mapování protein–proteinových interakcí a strukturální analýzu přímo v buňkách.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout robustní workflow pro crosslinking s DSPP a TBDSPP v in vitro (BSA) i in vivo (HeLa buňky), optimalizovat deprotekci a fosfoobohacení a sladit je s komerčním EasyPep přípravkem vzorků. Studie porovnávala tradiční činidla (DSS, DSSO) s fosfo-obohatitelnými agenty a hodnotila výtěžnost identifikovaných crosslinků.

Použitá metodika

• Crosslinking: DSPP a TBDSPP za molárních násobků 40× (BSA) nebo 2–2,5 mM (HeLa) v PBS pH 7,0; quenching amoniakem.
• Proteinová čistka: 10 kDa MWCO filtry (BSA), PAC nebo acetónová precipitace (HeLa).
• Redukce, alkylace, trypsin/LysC digest do 2–18 h.
• Deprotekce: TFA 2–3 % při 37 °C 1 h (peptidová úroveň); proteinová deprotekce vyšší TFA degraduje vzorek.
• Fosfoobohacení: Fe-NTA magnetické kuličky, optimální poměr 1:10 (slurry:vzorek).
• Peptidová čistka: tC18 resin a upravené EasyPep pufry pro vyšší ionickou sílu.

Použitá instrumentace

• UltiMate 3000 Nano LC (Thermo Scientific) s EASY-Spray sloupcem C18 (15 cm, 50 cm).
• Orbitrap Eclipse, Q Exactive Plus a Q Exactive HF (Thermo Scientific).
• Proteome Discoverer 2.3 s nodem XlinkX pro analýzu crosslinků.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizovaný workflow zvýšil počet detekovaných crosslinků 5–10× oproti DSS/DSSO a umožnil analýzu jednofrakčních běhů:

• TBDSPP pro in vivo crosslinking prokázal membránovou prostupnost a po deprotekci adekvátní obohacení.
• 2,5 % TFA/37 °C poskytuje nejlepší deprotekci peptidů bez významné degradace.
• PAC protokol zvyšuje identifikace a úplnost crosslinků oproti acetónové precipitaci.
• Úprava EasyPep pufrů umožňuje přímé zpracování crosslinkovaných vzorků se zvýšenou selektivitou při wash a eluci.

Přínosy a praktické využití metody

• Vyšší citlivost identifikace crosslinků v komplexních matricích (milníky v mapování interakcí).
• Redukce počtu kroků a času přípravy díky kompatibilitě s EasyPep.
• Možnost aplikace na buňky in vivo s vysokým výtěžkem strukturálních informací.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj multiplexních obohacovacích strategií a integrace s érou datově řízené proteomiky. Vývoj nových ochranných skupin a automatizace PAC protokolů povede k vyšší throughput a širší aplikaci v průmyslové a klinické analytice.

Závěr

Studie úspěšně demonstrovala, že fosfo-obohatitelná činidla DSPP a TBDSPP v kombinaci s optimalizovanou deprotekcí, PAC protokolem a upraveným EasyPep workflow dramaticky zvyšují identifikaci crosslinkovaných peptidů jak in vitro, tak in vivo. Zvýšená citlivost a zjednodušení přípravy vzorků otevírá nové možnosti pro detailní studium proteinových interakcí.

Reference

1. Steigenberger M. et al. Phox: an IMAC-enrichable Crosslinking Reagent. ACS Cent. Sci. 2019, 5, 1514–1522.
2. Pin Lian Jiang et al. A Membrane-Permeable and IMAC-Enrichable Cross-Linking Reagent to Advance In Vivo Cross-Linking Mass Spectrometry. Angew. Chem. Int. Ed. 2021, e202113937.
3. Batth T. S. et al. Protein Aggregation Capture on Microparticles Enables Multipurpose Proteomics Sample Preparation. Mol. Cell Proteomics 2019, 18, 1027–1035.