Evaluation of FAIMS Technology for Mass Spec Analysis of Chemical Cross-linked Peptides

Význam tématu

Analytická metoda spojující chemické křížové vázání peptidů a hmotnostní spektrometrii umožňuje detailní zmapování protein-proteinových interakcí. Nízký výtěžek křížově vázaných peptidů (<1 % ve směsi), složité matrice a nutnost frakcionace vyžadují nové řešení pro zvýšení citlivosti, selektivity a vazby na vysokou propustnost analýzy. Technologie FAIMS (High-Field Asymmetric Waveform Ion Mobility Spectrometry) nabízí plyn- fázi selekci iontů na základě jejich mobility v asymetrickém elektrickém poli, což slibuje vyšší signál-šu- m a lepší separaci křížově vázaných peptidů.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem studie bylo porovnat výkon FAIMS Pro rozhraní v Orbitrap Fusion Lumos mas- spektrometru s tradičními offline frakcionačními metodami (SCX, SEC) pro identifikaci chemicky křížo- vých peptidů. Studie hodnotila efekt FAIMS samotné i ve spojení s frakcionací na jednoduchých mode- lových proteinech (BSA, enoláza), v komplexních buněčných lyzátech a v izolovaných mitochondriích.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky byly připraveny reakcí s aminy reaktivními homobifunkčními křížovadly DSS, DSSO a DSBU na BSA, en- olázu, lidský lyzát HeLa a mitochondrie z myšího srdce.

• Redukce, alkylace a tryptická digestace
• Prefrakcionace: silně kationtoměnná chromato- grafie (SCX spin columns) a gelová filtrace (SEC)
• Kapalinová chromatografie: Dionex UltiMate 3000 nebo EASY-nLC 1200 s EASY-Spray kolónou (50 cm × 75 μm, 300 nL/min)
• Hmotnostní spektrometrie: Thermo Scientific™ Orbitrap Fusion™ Lumos Tribrid™ s Thermo Scientific™ FAIMS Pro™ Interface
• Data-driven frakcionace: interní CV stepping (dva až tři CV hodnoty ve stejném běhu) vs. externí CV stepping
• Softwarová analýza: Proteome Discoverer™ 2.3 s XlinkX 2.0 node a SEQUEST® HT; identifikace křížově vázaných spekter při 1 % FDR, XlinkX score ≥40, ΔXlinkX ≥4

Hlavní výsledky a diskuse

Všechny experimenty potvrdily, že FAIMS zvyšuje počet identifikovaných křížově vázaných peptidů i ve složitých vzorcích:

• Interní CV stepping (3 CV hodnoty, např. –50/–60/–75 V) vedlo k nejlepším identifikačním výsledkům oproti jed- noduchému CV nebo externímu střídání CV.
• FAIMS samostatně dokázal dosáhnout počtu identifikací srovnatelného s offline frakcionací SCX či SEC, přičemž výrazně snížil rušivé ionty podobného m/z.
• 2D FAIMS-SCX-XL-MS analýza mitochondriálního lyzátu zvýšila počet unikátních kontaktů přibližně dvakrát oproti jednorozměrnému přístupu.
• Optimalizované CV hodnoty se lišily podle vzorku, křížovadla a frakčního profilu eluce – pozdější SCX frakce vyžadovaly vyšší CV kvůli odlišnému rozdělení nábojových stavů.
• FAIMS zlepšil i kvantifikaci TMT značených křížově vázaných peptidů zvýšením přesnosti a opakovatelnosti signálu.

Přínosy a praktické využití metody

FAIMS Pro rozhraní nabízí několik klíčových výhod:

• Zrychlení workflow díky eliminaci nebo redukci offline frakcionace
• Vyšší propustnost a menší spotřebu vzorku při zachování nebo nárůstu identifikačních výkonů
• Lepší signál-/-šumové poměry a potlačení rušivých iontů obdobných m/z
• Kompatibilita s multiplexními kvantifikačními analýzami (TMT) a hlubokou proteomikou

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry dalšího rozvoje a aplikace FAIMS v křížově vázané proteomice:

• Automatizace optimalizace CV režimů pro různé typy vzorků a křížovadel
• Kombinace FAIMS s dalšími iontovými mobilitními technikami pro ještě vyšší separační kapacitu
• Integrace s online frakcionací a vyšším průtokem pro screening komplexních biologických matric
• Rozšíření do in vivo křížové vázání a mapování interaktomů v buňce i organelech
• Aplikace v oblasti strukturální proteomiky pro detekci prostorových topologií proteinových komplexů

Závěr

Thermo Scientific FAIMS Pro rozhraní významně zlepšuje identifikaci a kvantifikaci chemicky křížově vázaných peptidů při analýze na Orbitrap Fusion Lumos. Interní CV stepping představuje klíč k maximalizaci počtu spekter a kontaktních map, přičemž FAIMS může doplňovat nebo nahrazovat tradiční offline frakcionaci. Tím se zvyšuje efektivita workflow a otevírají nové možnosti pro detailní studium protein-proteinových interakcí.

Reference

1. Hebert AS, Prasad S, Belford MW et al. Comprehensive Single-Shot Proteomics with FAIMS on a Hybrid Orbitrap Mass Spectrometer. Anal Chem. 2018;90(15):9529–9537.
2. Pfammatter S, Bonneil E, McManus FP et al. A Novel Differential Ion Mobility Device Expands the Depth of Proteome Coverage and the Sensitivity of Multiplex Measurements. Mol Cell Proteomics. 2018 Oct;17(10):2051–2067.
3. Viner R, Bomgarden R, Singhal K et al. Enrichment strategies for improvement of mass spec analysis of chemical cross-linked peptides. 65th ASMS Conference. 2017.
4. Liu F, Lössl P, Rabbitts BM, Balaban RS, Heck AJR. The interactome of intact mitochondria by cross-linking mass spectrometry provides evidence for coexisting respiratory supercomplexes. Mol Cell Proteomics. 2018 Feb;17(2):216–232.
5. Creese AJ, Shimwell NJ, Larkins KP, Heath JK, Cooper HJ. Probing the complementarity of FAIMS and strong cation exchange chromatography in shotgun proteomics. J Am Soc Mass Spectrom. 2013;24(3):431–443.