Quantitative analysis of signaling pathways using TMT 11plex reagents and comprehensive phosphopeptide enrichment strategies

Význam tématu

Buněčná fosfoproteomika umožňuje odhalit dynamiku signálních drah, klíčových v buněčné proliferaci i patologiích. Kvantitativní analýza fosforylace vyžaduje citlivé a selektivní metody, které překonají nízkou hojnou dostupnost a krátkodobou povahu fosforylovaných peptidů.

Cíle a přehled studie

Studie se zaměřuje na rozšíření isobarického značení Tandem Mass Tag z 10 na 11 kanálů prostřednictvím zařazení varianty TMT11-131C a integraci se sekvenčním SMOAC protokolem pro obohacení fosfopeptidů. Cílem je komplexní kvantifikace fosfoproteinových změn v HeLa buňkách vystavených deseti různým stimulačním podmínkám.

Použitá metodika a instrumentace

Buňky HeLa byly kultivovány za deseti rozdílných podmínek, lyzovány a digested in-solution. Peptidy byly označeny TMT10plex a novou značkou TMT11-131C. Fosfopeptidy byly obohaceny pomocí SMOAC protokolu (nejprve TiO2, následně Fe-NTA). Frakcionace proběhla pomocí high pH reverzní fáze. Analyzovány byly na Orbitrap Fusion Tribrid LC-MS/MS. Data zpracována v Proteome Discoverer 2.2 s využitím Byonic, Sequest a PhosphoRS modulů.

Hlavní výsledky a diskuse

Workflow umožnil identifikovat více než 33 000 fosfopeptidů, z nichž ~24 000 bylo kvantifikováno s lokalizační přesností nad 90 %. SMOAC metodika vykázala dvojnásobné zvýšení počtu identifikací oproti jednoduché TiO2 enrichi. Kvantifikace odhalila změny v signálních drahách jako mTOR, MAPK, Estrogen nebo Notch a detailní analýza fosforylace RAF1 (Ser259, Ser289, Ser296) ukázala podmíněné, místo-specifické modulační vzorce.

Přínosy a praktické využití metody

Multiplexní TMT11plex workflow umožňuje paralelní analýzu až 11 vzorků v jedné LC-MS/MS analýze, výrazně redukuje čas a zvyšuje datovou propustnost. Vysoká selektivita a lokalizační jistota fosfopozičních míst zlepšují kvalitu dat v biologickém a farmakologickém výzkumu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další směřování zahrnuje rozšíření multiplexního značení nad 11 kanálů, integraci s dalšími posttranslačními modifikacemi, automatizaci SMOAC workflow a aplikace v klinickém proteomickém monitoringu. Vývoj softwarových nástrojů pro komplexní analýzu dat podpoří interpretaci signálních sítí.

Závěr

Kombinace TMT11plex značek, SMOAC obohacení a high pH RP frakcionace představuje robustní a efektivní platformu pro detailní kvantitativní analýzu fosfoproteomů. Nabízí vysokou hloubku pokrytí, citlivost a throughput, což umožňuje studium komplexních buněčných procesů.

Reference

• 1. Lombardi B, Rendell N, Edwards M, Katan M, Zimmermann JG. EuPA Open Proteom. 2015 Mar 1;6:10-15.
• 2. Erickson BK, Jedrychowski MP, McAlister GC, Everley RA, Kunz R, Gygi SP. Anal Chem. 2015 Jan 20;87(2):1241-9.
• 3. Viner R, Scigelova M, Zeller M, Oppermann M, Moehring T, Zabrouskov V. Thermo Fisher Scientific Application Note #566, 2012.
• 4. McAlister G, Huttlin EL, Haas W, Ting L, Jedrychowski MP, Rogers JC, Kuhn K, Pike I, Grothe RA, Blethrow JD, Gygi SP. Anal Chem. 2012;84:7469-7478.
• 5. Kall L, Canterbury J, Weston J, Noble WS, MacCoss M. Nature Methods. 2007;4:923-925.