Quantitative, comprehensive multi-pathway signaling analysis using an optimized phosphopeptide enrichment method combined with an internal standard triggered targeted MS assay

Význam tématu

Buněčná signalizace závisí na fosforylaci proteinů která reguluje klíčové procesy jako proliferaci apoptózu nebo metabolismus Precizní kvantifikace dynamiky fosforylace umožňuje lepší pochopení biologických mechanismů a identifikaci léčebných cílů

Cíle a přehled studie / článku

Studie se zaměřila na vývoj komplexního protokolu SMOAC obohaceného o 146 těžkých izotopových AQUA standardů a interně řízený cílený MS metodou SureQuant Cílem bylo dosáhnout precizní a reprodukovatelné kvantifikace fosfopeptidů z více signálních cest v buňkách HeLa a A549 stimulovaných EGF a IGF1

Použitá metodika a instrumentace

• Modelové systémy buňky HeLa a A549 po 24 hodinách hladovění sérem a stimulaci EGF nebo IGF1
• Lýza a příprava vzorku TEAB SDS univerzální nukleáza proteinový test BCA tryptická digest
• Fosfopeptidové obohacení sekvenční TiO2 a Fe-NTA pomocí SMOAC protokolu čištění C18 spin tips
• Chromatografie nanoLC se sloupci C18 a gradientem 5–30 % acetonitrilu během 120 minut při 300 nl/min
• Hmotnostní spektrometrie DDA DIA a cílená PRM analýza SureQuant na přístrojích Orbitrap Exploris 480 Q Exactive HF a Orbitrap Eclipse
• Software Proteome Discoverer pro DDA Skyline pro cílenou kvantifikaci PhosphoRS pro lokalizaci fosforylace

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizovaný SMOAC protokol významně zvýšil počet identifikovaných fosfopeptidů Cílená SureQuant analýza umožnila kvantifikovat více než 80 % standardních peptidů a celkově přibližně 134 endogenních fosfopeptidů Vylepšený poměr signál k šumu při použití Orbitrap Exploris 480 zajistil vyšší citlivost a přesnost Metoda prokázala reprodukovatelnou diferenciální fosforylaci mezi dvěma karcinomovými liniemi

Přínosy a praktické využití metody

• Multiplexní kvantifikace více fosfopeptidových motivů v jednom běhu
• Vysoká citlivost a selektivita díky internímu standardu a SureQuant triggerské metodě
• Reprodukovatelnost a snadná implementace v klinických a výzkumných laboratořích
• Možnost sledovat dynamiku signálních drah za různých stimulačních podmínek

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření panelu interních standardů o další signální proteiny a PTM motivy Integrace s datově nezávislou akvizicí DIA pro komplexní profilování Automatizace workflow a adaptace pro studium nízkopočetných vzorků single cell fosfoproteomika a translacní proteomika Vývoj bioinformatických nástrojů pro interpretaci komplexních fosfoproteomických dat

Závěr

Předložená metoda kombinuje optimalizované SMOAC obohacení těžké izotopové standardy a interně řízené cílené MS čímž umožňuje rychlou a robustní kvantifikaci fosforylace v více signálních drahách Tento přístup podstatně zvyšuje citlivost specifitu i reprodukovatelnost analýzy

Reference

1. Logue JS Morrison DK Complexity in the signaling network insights from the use of targeted inhibitors in cancer therapy Genes Dev 2012 26 7 641-50