Quantitative, comprehensive multi-pathway signaling analysis using an optimized phosphopeptide enrichment method combined with an internal standard triggered targeted MS assay

Význam tématu

Posttranslační modifikace, zejména fosforylace proteinů, hrají klíčovou roli v regulaci buněčných signálních drah řízením růstu, metabolismu a apoptózy. Kvantifikace fosfoproteomiky za různých biologických podmínek je nezbytná pro pochopení dynamiky těchto drah. Spolehlivá a citlivá analýza nízce zastoupených fosfoproteinů vyžaduje efektivní obohacení a cílené měření pomocí hmotnostní spektrometrie s interními standardy.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a ověřit komplexní metodu pro kvantitativní sledování více signálních drah současně. Autoři spojili optimalizovaný protokol SMOAC pro obohacení fosfopeptidů, panel 146 těžce značených AQUA standardů a dynamicky aktivované cílené měření SureQuant. Metoda umožňuje paralelní zpracování řady stimulovaných vzorků (HeLa, A549 buňky s hIGF-1 a hEGF) a vyhodnocení změn fosforylačního stavu více než 80 proteinů napříč sedmi drahami.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorků byly kultivovány buňky HeLa a A549, exponovány růstovými faktory po předchozím vyhladovění sérem, lysovány a proteiny digesovány enzymem trypsin.

• SMOAC obohacení: sekvenční použití TiO2 a Fe-NTA kitů (Pierce Hi-Select) pro izolaci fosfopeptidů.
• Interní standardy: 146 syntetických těžce značených fosfopeptidů AQUA (100 fmol na mg proteinu).
• Chromatografie: nanoLC separace na colonne EASY-Spray C18 a EASY-nLC 1200 / Dionex UltiMate 3000.
• MS akvizice: Orbitrap Exploris 480 a Orbitrap Eclipse (SureQuant, PRM), Q Exactive HF pro DDA, DIA.
• Data analysis: Proteome Discoverer 2.2 (Sequest HT, PhosphoRS), Skyline pro cílené kvantifikace.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizovaný SMOAC protokol zvýšil výtěžek a počet identifikovaných fosfopeptidů. Dynamické SureQuant spouštění na základě detekce těžkých peptidů umožnilo vysokou citlivost a reprodukovatelnost měření:

• Více než 90 % těžkých standardů bylo kvantifikováno s konzistentní citlivostí.
• Detekce přibližně 60 endogenních a 134 těžkých fosfopeptidů během jednoho běhu.
• Diferenciální fosforylace se lišila mezi HeLa (+hEGF) a A549 (+hIGF) buňkami, což dokládá schopnost metody odhalit biologicky relevantní změny.

Přínosy a praktické využití metody

Integrace interních standardů s cílenou MS akvizicí přináší:

• Jednorázovou analýzu až ~146 fosfopeptidů napříč vícero klíčovými signálními drahami.
• Vysokou citlivost, přesnost a specificitu díky SureQuant triggered MS2.
• Možnost standardizace workflow pro farmakologické šetření, biomarkerové studie a průmyslovou QA/QC.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj může zahrnovat:

• Rozšíření panelu interních standardů o další modifikace (ubikvitinace, acetylace).
• Automatizaci SMOAC protokolů pro vysokopropustné platformy.
• Integraci s bioinformatickými nástroji pro pokročilou analýzu sítí a stochiometrie fosforylace.
• Kombinaci s single-cell proteomikou pro mapování signálních dějů na úrovni jednotlivých buněk.

Závěr

Navržená metoda spojující SMOAC obohacení, těžké AQUA standardy a SureQuant poskytuje robustní řešení pro kvantitativní vícecestnou analýzu buněčných signálních drah. Díky vysoké citlivosti a reproducibilitě je vhodná pro výzkum dynamiky fosforylace, farmakologický screening i klinické aplikace.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific Orbitrap Exploris 480, Orbitrap Eclipse Tribrid, Q Exactive HF.
• Dionex UltiMate 3000 RSLCnano, EASY-nLC 1200, EASY-Spray C18 kolony.
• Pierce Hi-Select TiO2 a Fe-NTA obohacovací kity, EasyPep Mini MS Sample Prep, C18 Spin Tips.
• Software: Proteome Discoverer 2.2, Skyline.

Reference

1. Logue JS, Morrison DK. Complexity in the signaling network: insights from the use of targeted inhibitors in cancer therapy. Genes Dev. 2012 Apr 1;26(7):641–650.