Sensitive Bioanalysis of Antisense Oligonucleotides through Mitigation of Non‐specific Binding and Improved LC‐MS/MS Performance

Význam tématu

Analýza antisense oligonukleotidů (ASO) v biologických matricích je klíčová pro vývoj a monitorování oligonukleotidových terapeutik. Díky své vysoké polaritě a náchylnosti k nespecifickému vázání na povrchy a proteiny představují ASO značnou výzvu pro kvantitativní LC-MS/MS analýzu. Tento přístup se zaměřuje na potlačení nežádoucí absorpce a zajištění maximální citlivosti při nízkých koncentracích sub ng/mL v lidské plazmě.

Cíle a přehled studie / článku

Záměrem práce je ověřit reprodukovatelnost a citlivost LC-MS/MS metody pro analýzu panelu ASO různých délek a modifikací. Studie hodnotí lineární rozsah od 0,1 do 1000 ng/mL, optimální odstrannění nežádoucích interakcí a splnění přísných akceptačních kritérií pro kalibrátory a QC vzorky na třech různých dnech měření.

Použitá instrumentace

• UPLC systém Waters ACQUITY Premier s kolonkou Oligonucleotide C18 (1,7 µm, 2,1 × 50 mm)
• Tandemový hmotnostní spektrometr Waters Xevo TQ Absolute
• MaxPeak HPS technologie pro redukci nespecifického vázání
• MassPREP Oligonucleotide Separation Technology (OST) standards
• Auto sampler s 700 µL destičkami QuanRecovery a silikonovými víčky

Metodika

Vzorky plazmy (100 µL) byly extrahovány dvoustupňovým LLE protokolem (fenol:chloroform:isoamyl + chloroform), po usušení rekonstituovány v EDTA. Interním standardem byl oligonukleotid GEM91 (100 ng/mL). Chromatografie probíhala s mobilními fázemi obsahujícími HFIP a DIPEA ve vodě a v 80 % acetonitrilu, průtok 0,5 mL/min, teplota kolony 50 °C, objem injekce 15 µL.

Hlavní výsledky a diskuse

• Lineární kalibrační křivky (0,1–1000 ng/mL) vykázaly koeficienty determinace r2 > 0,99 (1/x2 vážení).
• Limita kvantifikace LLOQ = 0,1 ng/mL (0,2 ng/mL pro GalNAc oligonukleotid) byla dosažena pro všechny analyty.
• Přesnost a precize kalibrátorů a QC vzorků splňovaly kritéria ±15 % (±20 % pro LLOQ), RSD < 15 %.
• MaxPeak HPS technologie významně omezila nespecifickou adsorpci a kovové interakce.
• Metoda prokázala citlivost na úrovni sub ng/mL a dynamický rozsah pěti řádů pro ASO o délkách 18–33 nukleotidů.

Přínosy a praktické využití metody

Vyvinutá metoda umožňuje rutinní a robustní kvantifikaci antisense oligonukleotidů v lidské plazmě s vysokou citlivostí a opakovatelností. Potlačení nespecifického vázání zlepšuje spolehlivost výsledků a snižuje potřebu složité předúpravy vzorků.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření aplikace na multiplexní analýzu různě modifikovaných oligonukleotidů.
• Automatizace extrakčních postupů a integrace on-line odstraňování nežádoucích interakcí.
• Vývoj ještě citlivějších MS detektorů pro sub-pg úrovně kvantifikace.
• Adaptace metody pro rozmanité biologické matice (tkáně, cerebrospinální mok).

Závěr

Spojení UPLC systému Waters ACQUITY Premier a tandemového MS Xevo TQ Absolute s MaxPeak HPS technologií představuje vysoce citlivý a reprodukovatelný přístup pro bioanalytickou kvantifikaci antisense oligonukleotidů v lidské plazmě, splňující požadavky na nízké koncentrace i široký dynamický rozsah.

Reference

1. Suma Veeramachineni, Mark Wrona, Sensitive LC-MS/MS Bioanalytical Quantitation of Antisense Oligonucleotides, Waters Corporation, Application Notes, 720007574, March 2022.
2. Jennifer M. Nguyen et al., Assessing the impact of nonspecific binding on oligonucleotide bioanalysis, Future Science, Bioanalysis, Vol. 13, No. 16.
3. Guilherme J. Guimaraes et al., Impact of Nonspecific Adsorption to Metal Surfaces in Ion Pair-RP LC-MS Impurity Analysis of Oligonucleotides, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 208, 114439, 2022.