A Robust Workflow for Biosimilar Comparability Assessment via Intact and Subunit RPLC-MS and Native IEX-MS with a Prototype Benchtop QTOF

Význam tématu

Monoklonální protilátky vyžadují detailní komparativní analýzu pro potvrzení biosimilarity a zajištění kvality produktu. Kombinace hmotnostní spektrometrie a chromatografie umožňuje citlivou detekci klíčových atributů, jako jsou glykosylace a variace C-terminálních lyzinů.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout robustní workflow pro porovnání originálního infliximabu (Remicade) a tří biosimilárních látek (Inflectra, Avsola, Renflexis) na intaktní úrovni i na úrovni subjednotek po enzymatickém štěpení IdeS. Studie se zaměřila na charakterizaci N-glykoform a nábojových variant.

Použitá instrumentace

• Xevo G3 QTof hmotnostní spektrometr
• ACQUITY Premier BEH C4 kolona pro RPLC
• BioResolve SCX mAb kolona pro IEX
• UNIFI a waters_connect platformy pro akvizici a zpracování dat
• INTAC Mass Applications software

Použitá metodika

Intaktní analýzy proběhly v denaturačních podmínkách metodou RPLC-MS a nativním režimu IEX-MS. Subjednotky Fc a Fab+LC po štěpení IdeS byly analyzovány RPLC-MS. Spektra byla dekonvoluována pomocí MaxEnt1 pro přesné stanovení hmotností a relativní kvantifikaci variant až do 1–5 % abundance.

Hlavní výsledky a diskuse

• Intaktní RPLC-MS umožnila rozlišení hlavních N-glykoform do 5 % relativní abundance a identifikaci rozdílů v C-terminálních lyzinových variantách.
• IEX-MS v nativním režimu potvrdila přítomnost tří hlavních lyzinových forem enzymatickou kontrolou carboxypeptidázou B.
• Subjednotková RPLC-MS detekovala Fc N-glykoformy až do 1 % a odhalila immunogenní glykanové struktury (NeuGc, α-Gal).
• IEX-MS subjednotky identifikovala kyselé varianty pravděpodobně způsobené deamidací či konformačními změnami.
• Nejvýraznější rozdíly mezi originálem a biosimilary byly zjištěny v C-terminálních lyzinách a složení N-glykanů.

Přínosy a praktické využití metody

• Komplexní profilování kritických kvalitativních atributů biosimilárních mAb.
• Vysoká citlivost a rozlišení pro detekci nízkoabundantních variant vhodné pro regulační schválení.
• Integrované workflow RPLC-MS a IEX-MS šetří čas a materiál díky jednomu analytickému řešení.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Zvýšení rozlišení hmotnostních analyzátorů pro detekci ultranízkých variant.
• Implementace umělé inteligence pro automatizovanou interpretaci MS dat a předpověď modifikací.
• Rozšíření metody na další biologické léčivé látky, včetně konjugátů s cytotoxiny.
• Vývoj plně nativních workflow pro studium konformačních změn proteinů.

Závěr

Navržené RPLC-MS a IEX-MS metodiky na platformě Xevo G3 QTof poskytují robustní a citlivé nástroje pro detailní komparativní analýzu biosimilárního infliximabu. Spojení intaktní a subjednotkové analýzy zajišťuje komplexní profilování glykosylací a nabíjecích variant pro dodržení kvality a regulačních požadavků.