Multi-Attribute Methods for Biopharmaceutical Analysis

Význam tématu

Analytické metody založené na LC-MS pro vícenásobnou detekci a kvantifikaci kvalitativních atributů bioterapeutik (tzv. multi-attribute method, MAM) se stávají klíčovým nástrojem od raného vývoje až po uvolňování sérií v rámci QC. Přímé sledování modifikací proteinů (oxidace, deamidace, glykozylace, C-terminální variace aj.) nabízí vyšší citlivost a specifičnost než klasické chromatografické testy s optickou detekcí. Rychlé, automatizované a regulacím vyhovující pracovní postupy jsou nezbytné pro škálovatelnost, kontrolu výrobních procesů a zajištění konzistentní kvality lékových produktů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo představit portfolio aplikací a workflow pro LC-MS atributové analýzy bioterapeutik od úrovně peptidů po subjednotky až po celou molekulu:• implementace vysoce citlivých HRMS a platformy waters_connect pro polynukleotidní i peptidové MAM• využití ACQUITY Premier a HPS povrchů pro minimalizaci adsorpce a zlepšení odezvy kyselých peptidů• srovnání inovátora a biosimilárních mAb na Xevo G3 QTof s aplikacemi UNIFI a waters_connect• jednoduchá LC-MS identifikace CDR peptidů a sledování PTM na ACQUITY QDa s Empower CDS• robustní subjednotkové workflow IdeS/DTT s BioAccord, Vion IMS a waters_connect pro rychlou MAM analýzu• představení aplikace INTACT Mass™ pro vysokopropustné potvrzení hmotnosti a čistoty intact molekul• automatizace Protein A retenčního očistného kroku a IdeS digesce pomocí robotu Andrew+ pro rychlé subjednotkové screeningy

Použitá metodika a instrumentace

• LC: Waters ACQUITY UPLC I-Class/Classic, Premier, BioAccord, BioResolve RP mAb Polyphenyl, Protein BEH C4• MS: ACQUITY RDa, Xevo G3 QTof, Vion IMS-QTof, ACQUITY QDa• Digesce: FabRICATOR (IdeS) + DTT; PNGase F deglykozylace• Čištění: Magne® Protein A mikroperly na Andrew+ robotu• Informatika: waters_connect (UNIFI App, Peptide MAM App, INTACT Mass), Empower CDS pro QDa• Parametry: krátké gradienty 2,5–4,5 min, destilační LC-MS, inteligentní zachycování dat (IDC), bayesovská nebo MaxEnt1 dekonvoluce

Hlavní výsledky a diskuse

• Peptidové MAM workflow s waters_connect poskytlo stabilní kvantifikaci modifikací s RSD < 5 % mezi systémy a nízkou mírou falešných poplachů při detekci nových špiček• HPS povrchy v ACQUITY Premier zdvojnásobily signál kyselých peptidů a zlepšily datovou kvalitu fragmentace• Porovnání biosimilárních a referenčních mAb na Xevo G3 QTof ukázalo konzistentní > 95 % pokrytí sekvencí a rozdíly v glykozylaci, deamidaci, oxidaci a C-terminálním klipování• ACQUITY QDa s Empower umožnil jedinou analýzu CDR, PTM i glykovariant pro potvrzení identity a rutinní monitoring• Subjednotkové MAM na BioAccord a Vion IMS dokázalo jednoduše sledovat glykozylaci, glykaci, oxidaci i varianty sekvence v 15 min LC-MS cyklu• INTACT Mass App a LC-MS Toolkit v waters_connect zautomatizovaly dekonvoluci, detekci špiček, měření čistoty a generování zpráv

Přínosy a praktické využití metody

• Vyšší propustnost díky rychlým gradientům a minimalizaci přípravou vzorku
• Automatizace čištění i digesce vzorků z bioreaktorů (micro- i makro-) s roboty Andrew+
• Platformní metody aplikovatelné na různorodé bioterapeutické molekuly
• Komplexní sledování klíčových atributů v jedné LC-MS injekci
• Regulacím vyhovující prostředí waters_connect pro audit trail, správu knihoven a generování šablonových reportů

Budoucí trendy a možnosti využití

• Důsledná automatizace a integrace přípravy vzorku, LC-MS a datové analýzy ve vícedisciplinárních laboratořích
• Rozšíření MAM pro bispecifické a konjugované protilátky, vakcínové komponenty či glykosylované proteiny
• Vazba probíhající on-line monitoring buněčných kultur a řízení procesů v reálném čase
• Vývoj AI nástrojů a strojového učení pro pokročilé vyhodnocení nových špiček a predikci rizik atributů

Závěr

Implementované workflow poskytují robustní, rychlou a citlivou platformu pro sledování kritických atributů bioterapeutik. Od peptidových map přes subjednotky až po intact molekuly nabízejí LC-MS metody na systémech BioAccord, ACQUITY, Xevo či Vion v kombinaci s waters_connect a Empower integrované řešení pro vývoj, výrobu a QC. Rozvoj těchto přístupů dále posune efektivitu i kvalitu biopharma průmyslu a umožní rychlejší zavádění nových léčiv na trh.

Reference

1. Rogers RS et al., mAbs 7(5):881–890 (2015)
2. Ranbaduge N, Yu YQ, Waters App Note 720007094 (2020)
3. Shion H et al., Waters Vblog (2022)
4. Dong J et al., Anal. Chem. 88:8673–8679 (2016)
5. Sokolowska I et al., mAbs 9(3):498–505 (2017)
6. Birdsall RE, Waters App Note 720005377 (2015)
7. GlycoWorks RapiFluor-MS Kit Care & Use (Waters)