Comprehensive Biosimilar Comparability Assessment via Intact and Subunit RP-MS and IEX-UV-MS Using the Xevo™ G3 QTof System

Význam tématu

Se vzrůstající dostupností biosimilárních monoklonálních protilátek (mAb) ve farmaceutickém výzkumu a vývoji roste i potřeba robustních analytických metod pro potvrzení jejich srovnatelnosti s originálními produkty. Různé posttranslační modifikace (PTM) mohou ovlivnit účinnost, bezpečnost a imunogenicitu mAb. Komplexní LC-MS metody umožňují rychlou a přesnou charakterizaci biosimilárních přípravků na úrovni celých molekul i jejich podjednotek, což je zásadní pro regulatorní schválení a udržení kvality produktu.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavním cílem byla demonstrace porovnávací analýzy originálního infliximabu (Remicade®) a tří jeho biosimilárních verzí (Inflectra®, Avsola®, Renflexis®) pomocí:

• intaktního a subjednotkového RP-LC-MS,
• natívního IEX-UV-MS;

Datová analýza a zpracování proběhly v platformě waters_connect s aplikacemi UNIFI a INTACT Mass.

Použitá metodika a instrumentace

Studie kombinovala několik komplementárních metod:

• RP-LC-MS intaktního mAb a IdeS-digestovaných podjednotek (C4 kolona při 80 °C),
• natívní iontově výměnnou chromatografii (IEX) spojenou s UV (280 nm) a MS detekcí (BioResolve SCX mAb kolona při 30 °C),
• enzymatické odstranění C-terminálních lysinů (karboxypeptidáza B) pro zjednodušení kvantifikace N-glykoforem,
• Inteligentní sběr dat (IDC) pro vylepšení kvality spekter a zmenšení souborů.

Aplikovaná instrumentace:

• ACQUITY Premier UPLC systém
• Xevo G3 QTof hmotnostní spektrometr
• Software waters_connect s UNIFI App a INTACT Mass App

Hlavní výsledky a diskuse

1. Intaktní RP-LC-MS:

• Rozdíly v C-terminálních lysinových variantách – Remicade a Inflectra ~48 % nenavázaných lysinů, Avsola ~35 %, Renflexis ~5 %.
• Distribuce hlavních N-glykoforem velmi podobná, s nepatrnými odchylkami (Man5, A2).

2. RP-LC-MS subjednotek (IdeS digest):

• Detekce imunogenních N-glykanů (Neu5Gc) u Remicade a Inflectra (Sp2/0 expresní systém), absentující u CHO-produkovaných Avsola a Renflexis.
• Glykace lehkého řetězce a Fd podjednotek <0,5 % u Remicade, 2–3 % u biosimilárů.

3. Natívní IEX-UV-MS:

• Vyprofilování nabitých variant podle UV %Area; MS detekce umožnila specifickou identifikaci jednotlivých špiček (0K, 1K, 2K lysiny, deamidace, odlišné glykovarianty).
• Subjednotková IEX-UV-MS: separace (Fc)2 a (Fd+LC)2 usnadnila rychlou detekci modifikací v CDR oblasti bez nutnosti rozsáhlého peptidového mapování.

Přínosy a praktické využití metody

• Kombinace intaktního a subjednotkového RP-LC-MS s IEX-UV-MS poskytuje orthogonální data, která se vzájemně potvrzují.
• Rychlé screeningové workflow pro detekci zásadních PTM a variant s minimální úpravou vzorku.
• Regulatorní výhoda – detailní charakterizace glykoformy, lysinových a nabitých variant zkracuje čas potřebný pro porovnání a schválení biosimilárního produktu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace a vysokopropustné platformy pro hromadné porovnání více šarží.
• Rozšíření aplikace IDC a strojového učení pro predikci a monitorování vzniku PTM během výroby a stability.
• Integrace dalších orthogonálních technik (HDX-MS, CE-MS) pro komplexní charakterizaci strukturálních změn v CDR.

Závěr

Systematická analýza infliximabových biosimilárů ukázala, že Xevo G3 QTof v kombinaci s ACQUITY Premier UPLC a waters_connect platformou nabízí spolehlivé a detailní workflow pro srovnání intaktních mAb a jejich podjednotek. Orthogonální přístup založený na RP-LC-MS a IEX-UV-MS poskytuje regulatorně relevantní data o glykoformách, lysinových a nabitých variantách, což zrychluje a usnadňuje porovnávací hodnocení biosimilárních produktů.

Reference

1. FDA: Biosimilar Development, Review, and Approval (2022).
2. Jung SK a kol.: Physicochemical Characterization of Remsima. mAbs 6(5):1163–1177 (2014).
3. Hong J. a kol.: Physicochemical and Biological Characterization of SB2. mAbs 9(2):365–383 (2017).
4. Lee C. a kol.: Glycosylation Profile of Remicade vs Flixabi a Remsima. mAbs 9(6):968–977 (2017).
5. Mortishire-Smith R. a kol.: Intelligent Data Capture for High Resolution MS. Waters White Paper (2019).