Trapped Ion Mobility Spectrometry and PASEF Enables In depth Characterization of Protein Ubiquitination

Význam tématu

Ubiquitinace je posttranslační modifikace klíčová pro regulaci degradace proteinů, imunitní odpovědi, signalizace a opravy DNA. Detailní proteomová charakterizace ubiquitinace čelí výzvám nízké stechiometrie modifikovaných peptidů a koeluce izobarických forem.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo demonstrovat schopnost kombinace trapované iontové mobility (TIMS) a paralelního akumulace-selektivního fragmentačního režimu (PASEF) na spektrometru timsTOF Pro pro hlubokou, reprodukovatelnou analýzu ubiquitinačních lokalit v lidských buněčných lyzátech HeLa a 293T.

Použitá metodika

Ubiquitinované peptidy byly obohaceny z 2 mg buněčných lyzátů pomocí protilátkového kitu PTM Biolabs. Peptidy se separovaly na C18 koloně (25 cm, 100 µm i.d., 1,9 µm) při průtoku 450 nL/min a 50min gradientu (2–37 % ACN/0,1 % FA). Pro identifikaci a kvantifikaci byly zpracovány data v MaxQuant (Human SwissProt, FDR 1 %, min. ion score 40).

Použitá instrumentace

• NanoElute LC (Bruker Daltonics)
• timsTOF Pro Q-TOF MS s trapovanou iontovou mobilitou a režimem PASEF

Hlavní výsledky a diskuse

Technické repliky vykázaly vysokou shodu (Pearson R = 0,97). V HeLa bylo identifikováno přes 8 700 ubiquitinačních míst, v 293T více než 10 000, celkem pak přes 17 000 lokalit na 5 093 proteinech při jediném 50min běhu. Dodatečná dimenze iontové mobility umožnila rozlišení koelujících izobarických peptidů s různými pozicemi modifikace, čímž se zvýšila přesnost lokalizace ubiquitinace.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká citlivost a pokrytí ubiquitinačních lokalit i při krátkých LC bězích
• Vynikající reprodukovatelnost kvali- a kvantitativních dat pro robustní srovnání vzorků
• Rozlišení izomerických peptidů zlepšuje přesnost lokalizace modifikací

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace více dimenzí separace může dále rozšířit pokrytí vzácných posttranslačních modifikací. Kombinace s cílenými kvantitativními režimy (PRM/SRM) a aplikace v klinické proteomice otevírá cestu ke standardizaci modifikačních profilů v QA/QC i farmaceutickém průmyslu.

Závěr

Kombinace TIMS a PASEF na timsTOF Pro s vysoce selektivním obohacením poskytuje bezprecedentní hloubku a spolehlivost charakterizace ubiquitinace, což představuje silný nástroj pro výzkum posttranslačních modifikací.

Reference

1. He et al., Plant J. 2020;101(6):1430–1447
2. Meier F. et al., Mol Cell Proteomics. 2018;17(12):2534–2545