High sensitivity and high-throughput label free interaction proteomics using PASEF® on the timsTOF Pro mass spectrometer

Význam tématu

Proteinové interakce řídí funkční výsledky biologických systémů a jejich detailní pochopení je zásadní pro biomedicínský výzkum i průmyslovou analytiku. Moderní přístupy vyžadují kombinaci citlivosti a vysoké propustnosti, aby bylo možné systematicky mapovat interaktomy i při omezeném množství vzorku.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo demonstrovat výkonnost bezznačkované interakční proteomiky s využitím technologie PASEF na hmotnostním spektrometru timsTOF Pro. Studie porovnává výsledky 90minutových a 45minutových gradientů při nízkém vstupním množství vzorku odpovídajícím 12jamkové destičce buněčné kultury.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorky: buněčné lyzáty z 6- a 12jamkových destiček (250 µg proteinu) inkubované s paramagnetickými kuličkami navázanými na bait-peptid versus scramble-kontrolu.
• On-bead trávení trypsinem a následná desalinace StageTipem.
• Chromatografie: Thermo Easy‐LC 1200 s 15 cm kapilární kolonkou, analýza v replikátech (n=4).
• Hmotnostní spektrometrie: Bruker timsTOF Pro v režimu PASEF, standardní metody v oTOFControl (90 a 45 min gradient).
• Softwarové zpracování: MaxQuant 1.6.7.0 s MaxLFQ, „match between runs“ včetně 4D zpracování CCS hodnot, analýza v Perseus; FDR 1 % pro peptidy i proteiny.

Hlavní výsledky a diskuse

• PASEF na timsTOF Pro zvýšil počet identifikovaných proteinů o ~24 % při 90 min gradientu a o ~15 % při 45 min ve srovnání s předchozí platformou.
• I kratší 45minutové analýzy dosahují lepší hloubky pokrytí než dřívější 90minutové běhy.
• Vysoká korelace replikátů (r > 0,96) potvrzuje spolehlivost kvantifikace.
• PCA jasně odděluje bait a kontrolní pulldown vzorky.
• Volcano plot odhalil pět z deseti očekávaných přímých interaktorů a řadu nových kandidátů včetně nepřímých vazebných partnerů.

Přínosy a praktické využití metody

• Možnost práce s nízkým množstvím vzorku odpovídajícím formátu 6–12 jamkové destičky.
• Výrazné zvýšení citlivosti umožňuje detekci nízkoho počtu molekul.
• Vysoká propustnost díky PASEF zkracuje celkový čas analýzy.
• Vhodné pro systematické mapování interaktomů a vyhledávání posttranslačních modifikací.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Implementace ultrakrátkých gradientů (např. 21 min na platformě Evosep) pro ~60 vzorků/den.
• Rozšíření na multifaktoriální globální interaktomické studie v kvadrplikátech.
• Optimalizace pro různé pufry a podmínky vazby k rozlišení přímých a nepřímých interakcí.
• Aplikace v klinickém výzkumu a screening malých molekul ovlivňujících protein–proteinové interakce.

Závěr

Analýza s využitím PASEF na timsTOF Pro kombinuje vysokou citlivost a propustnost pro bezznačkové interakční proteomické studie. Umožňuje detailní mapování proteomů i při nízkém množství vzorku a nabízí reálnou cestu k vysokopropustným interaktomickým experimentům.

Reference

1. Meier F, et al. J Proteome Res. 2015.
2. Meier F, et al. Mol Cell Proteomics. 2018.
3. Prianichnikov N, et al. Mol Cell Proteomics. 2020.