Accurate Label-Free Protein Quantitation on the timsTOF Pro with 4D-Proteomics™

Význam tématu

Proteomická analýza bez značení proteinů umožňuje detailní profilování širokého spektra vzorků s vysokou citlivostí a reprodukovatelností. Metoda se uplatňuje v oborech od fundamentálního výzkumu až po průmyslovou kontrolu kvality.

Cíle a přehled studie

Tento článek demonstruje výhody kombinace technologie trapped ion mobility spectrometry (TIMS) a Parallel Accumulation Serial Fragmentation (PASEF) na platformě timsTOF Pro pro label free kvantifikaci proteinů. Studie hodnotí výkon systému na standardním HeLa celulárním digestu a na komplexní směsi tří proteomů (člověk, kvasinka, E coli) v předdefinovaných poměrech.

Použitá instrumentace

• HPLC systém nanoElute Bruker Daltonics
• Reverzní fází C18 kolona (25 cm × 75 µm, 1,6 µm, IonOpticks)
• Masový spektrometr timsTOF Pro s dual TIMS optikou a PASEF akvizicí

Použitá metodika

• Příprava vzorku: lýza HeLa buněk v TFE, redukce DTT, alkylace IAA, enzymatické štěpení trypsinem, čištění SPE SepPak C18
• Směs tří proteomů: HYE-A (65 % lidské, 30 % kvasinky, 5 % E coli), HYE-B (65 % lidské, 15 % kvasinky, 20 % E coli), 400 ng nálože
• Chromatografie: gradient 2–37 % B za 100 min, průtok 400 nL/min, teplota kolony 50 °C
• MS nastavení: m/z 100–1700, 10 PASEF MS/MS scanů za cyklus, průměrně 12 prekurzorů na scan, TIMS ramp 166 ms, kolizní energie 20–59 eV
• Zpracování dat v PEAKS Studio Xplus: MS tolerance 20 ppm, MS/MS tolerance 0,05 Da, variabilní modifikace oxidace metioninu a N-terminální acetylace, fixní karbamidometylace cysteinu, ID transfer mezi běhy s korelací kolizně podmíněných průřezů (CCS)

Hlavní výsledky a diskuse

HeLa digest: průměrně 63 893 peptidů, 85 % společných ve všech třech injekcích a ~6 100 proteingrup na běh. Směs tří proteomů: průměrně 64 334 peptidů, 8 410 proteingrup na běh, celkem 89 835 peptidů a 9 467 proteingrup. Reprodukovatelnost kvantifikace vysoká s korelacemi okolo 0,99. Kvantitativní poměry blízko očekávaným (lidský ~1:1, kvasinkový ~2,5:1, E coli ~0,2:1).

Přínosy a praktické využití metody

Platforma timsTOF Pro s PASEF nabízí vysokou sekvenační rychlost, vynikající citlivost a dynamický rozsah přes 5 řádů. Label free kvantifikace je vhodná pro rutinní proteomické workflow v akademických i průmyslových laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj TIMS a PASEF směřuje k vyšší propustnosti a citlivosti, rozšíření do klinických aplikací, multiomics přístupů a integraci strojového učení pro analýzu 4D datových sad.

Závěr

timsTOF Pro s PASEF technologií umožňuje robustní a přesnou kvantifikaci proteinů bez značení s vysokou reprodukovatelností a rozlišením, což činí tuto platformu ideální pro vysoce propustné proteomické analýzy.

Reference

1. Meier F et al Mol Cell Proteomics 2018 doi:10.1074/mcp.TIR118.000900
2. Wang et al J Proteome Res 2005 4(6):2397-2403
3. Navarro P et al Nat Biotechnology 2016 doi:10.1038/nbt.3685