High sensitivity lysine acetylation profiling with Trapped Ion Mobility Spectrometry and PASEF

Význam tématu

Lysinková acetylace patří mezi zásadní posttranslační modifikace ovlivňující transkripční regulaci, buněčný cyklus i metabolické dráhy. Její kvantifikace a lokalizace v komplexních biologických vzorcích je však komplikována nízkou abundancí acetylovaných peptidů, širokým dynamickým rozsahem a aktivitami deacetyláz.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo vyvinout vysoce citlivý a rychlý přístup k profilování lysinové acetylace v rostlinných a živočišných vzorcích. Autoři demonstrovali workflow založené na vysokopevnostní afinitní enrichaci acetylovaných peptidů a jejich analýze pomocí zachycené iontové mobility (TIMS) kombinované s PASEF na platformě Bruker timsTOF Pro.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky (myší játra, listy rýže Oryza sativa) byly diges­továny trypsinem a obohaceny o acetylované peptidy pomocí soupravy PTM-104 (PTM Biolabs). Analýza proběhla na nanoUHPLC nanoElute (Bruker Daltonics) s C18 kolonou (25 cm × 100 µm, 2 µm částice) při průtoku 450 nL/min a gradientu 5–22 % organiky za 50 min. Spektra byla pořízena na timsTOF Pro v režimu PASEF a zpracována v MaxQuant a Mascot s FDR < 1 %.

Hlavní výsledky a diskuse

Výsledky ukázaly extrémní hloubku pokrytí acetylace:

• V devíti listech rýže přes 4800 proteinových skupin a téměř 18000 acetylovaných lysinových míst z jednoho běhu.
• V myších játrech identifikace přes 1800 acetylovaných peptidů z 100 µg vzorku během 50 min gradientu.

TIMS poskytlo dodatečnou dimenzi separace, což umožnilo rozlišení koelutujících peptidů se stejným m/z a retenčním časem a tím správné přiřazení modifikační pozice. Biologická reprodukovatelnost dosahovala R2 > 0,94.

Přínosy a praktické využití metody

Díky kombinaci vysoké afinity enrichmentu a rychlého, citlivého měření TIMS-PASEF lze efektivně profilovat acetylaci v omezených množstvích vzorku a při krátkém LC běhu. Metoda je vhodná pro rozsáhlé studie posttranslačních modifikací, dynamické sledování buněčných stavů či kvalitativně-kvantitativní analýzy v průmyslové a biomedicínské praxi.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s dalšími obohacovacími strategie pro komplexní PTM profiling.
• Rozšiřování metodiky na single-cell proteomiku a klinické vzorky.
• Využití pokročilých algoritmů strojového učení pro lepší identifikaci a lokalizaci modifikací.

Závěr

Protokol založený na enrich­ mentu acetylovaných peptidů a analýze TIMS-PASEF na timsTOF Pro poskytuje vysokou citlivost, rychlost a reprodukovatelnost při komplexním profilování lysinové acetylace v rostlinných i živočišných vzorcích.

Reference

Meier F. et al. Journal of Proteome Research (2015)