High Sensitivity SISCAPA-based Peptide Quantitation Using UHPLC and the 6490 QQQ with iFunnel Technology

Význam tématu

Proteinové biomarkery v nízkých koncentracích v plazmě vyžadují vysoce citlivé a specifické analytické metody. SISCAPA technologie spojuje imunoafinitní obohacení cílových peptidů s kvantitativní detekcí pomocí LC-MRM MS, čímž dosahuje sub-ng/mL až sub-fmol úrovní detekce. Významným tématem je zejména robustnost, vyšší průchodnost a opakovatelnost v klinických a výzkumných laboratořích, kde tradiční nanoflow chromatografie často limituje efektivitu analýzy.

Cíle a přehled studie

Studie se zaměřila na porovnání standard-flow chromatografie s high-sensitivity systémem Agilent 6490 QQQ s iFunnel technologií oproti tradiční nanoflow LC-MRM pro multiplexní SISCAPA assay s 11 protilátkami. Cílem bylo optimalizovat vysokopropustný workflow, dosáhnout citlivosti komparabilní s nanoflow a podstatně zvýšit počet vzorků na časovou jednotku.

Použitá metodika a instrumentace

Workflow staví na následujících krocích:

• Proteolytická digestace vzorku plazmy trypsinem
• Imunoprecipitace cílových peptidů pomocí 11 rabbit monoclonal protilátek (RabMAbs) na magnetických kuličkách
• Automatizace procesu na platformě Agilent Bravo (96-well formát)
• Eluce peptidů v kyselém roztoku a následná kvantifikace LC-MRM MS

Instrumentace:

• Agilent 1290 Infinity LC systém s kolonkou Eclipse Plus EC-C18 1.8 µm, 2.1×50 mm, 35 °C, flow 0.6 mL/min
• Agilent 6490 Triple Quadrupole MS s iFunnel technologií a Agilent Jet Stream zdrojem
• Hexabore kapilára a dvoustupňový ion funnel pro zvýšenou přenosnost iontů
• Automatizační robot Agilent Bravo pro SISCAPA obohacení

Hlavní výsledky a diskuse

Standard-flow LC-MRM dosáhla citlivosti srovnatelné s nanoflow, přičemž plazmové peptidy byly měřitelné z 10 µL digestu s dolní mezí kvantifikace v řádu 50 amol až několik fmol na vzorek. Výsledky pro 11 multiplexovaných peptidů ukazují:

• CV v rámci jedné dávky 2 až 8 %
• Snížení doby analýzy z 30 na 5 minut
• Nárůst průchodnosti vzorků až šestinásobně

Optimalizované gradienty a MRM přechody zajistily ostré špičky a reprodukovatelné retence, což potvrdilo robustnost metody v klinickém provozu.

Přínosy a praktické využití metody

Díky vysoké citlivosti, krátkému času analýzy a automatizaci SISCAPA protokolu je metoda vhodná pro velké klinické studie, validaci biomarkerů a rutinní QA/QC v farmaceutickém průmyslu. Standard-flow platforma s iFunnelem přináší:

• Jednodušší údržbu oproti nanoflow
• Vyšší reproducibilitu a stabilitu během dlouhodobých měření
• Možnost rychlé adaptace multiplexních panelů

Budoucí trendy a možnosti využití

Vývoj dále směřuje k rozšíření multiplexu nad deset peptidů, integraci s novými ionizačními zdroji a zkrácení doby obohacení. Kombinace SISCAPA s vysokorychlostními MS systémy a umělou inteligencí pro analýzu dat otevírá perspektivu plně automatizovaných prognostických testů v klinické praxi.

Závěr

Studie prokázala, že standard-flow LC se systémem Agilent 6490 QQQ s iFunnel technologií nabízí citlivost a robustnost srovnatelnou s nanoflow SISCAPA assay, přičemž dramaticky zvyšuje průchodnost a usnadňuje implementaci v rutinní laboratorní praxi.

Reference

1. Hoofnagle A. et al. Quantification of Thyroglobulin, a Low-Abundance Serum Protein, by Immunoaffinity Peptide Enrichment and Tandem Mass Spectrometry. Clinical Chemistry. 2008;54(11):1796-1804.
2. Anderson L. et al. Automation of a SISCAPA Magnetic Bead Workflow for Protein Biomarker Quantitation by Mass Spectrometry Using the Agilent Bravo Automated Liquid Handling Platform. Agilent Application Note. 2011;5990-7360EN.