Automated, High Precision Tryptic Digestion and SISCAPA-MS Quantification of Human Plasma Proteins Using the Agilent Bravo Automated Liquid Handling Platform

Význam tématu

Analýza proteinů v lidské plasmě je klíčová pro identifikaci a kvantifikaci biomarkerů ve výzkumu i klinické praxi. Vysoce přesná tryptická digesce v kombinaci s obohacením cílových peptide pomocí SISCAPA a následnou hmotnostní spektrometrií umožňuje detekovat a kvantifikovat proteiny na úrovni jednotek fmol. Automatizace tohoto postupu zároveň významně snižuje variabilitu a zvyšuje propustnost analýzy.

Cíle a přehled studie

Studie si klade za cíl vyvinout plně automatizovaný protokol pro tryptickou digesci a SISCAPA obohacení v 96 jamkové formě na platformě Agilent Bravo. Dále byla ověřena schopnost multiplexního měření čtyř modelových proteinů v plazmě v širokém rozsahu koncentrací s vysokou citlivostí, linearitou a reprodukovatelností.

Použitá metodika a instrumentace

• Trypsiní štěpení bez mezikroků (addition only) na Agilent Bravo Automated Liquid Handling Platform v 96 jamkách
• Obohacení cílových peptide pomocí SISCAPA kitu s magnetickými kuličkami obalenými antipeptidovými protilátkami
• Vlastní magnetická destička pro separaci mikrokuliček a provedení tří mycích kroků
• Eluce peptide kyselinou a přímá příprava vzorku pro LC/MS/MS
• UHPLC Agilent 1290 Infinity pro separaci peptide
• Triple kvadrupolový hmotový spektrometr Agilent 6490 TQMS pro kvantifikaci
• Software Agilent MassHunter pro akvizici a kvantitativní zpracování dat

Hlavní výsledky a diskuse

- Limit detekce (LOD) a kvantifikace (LOQ) pro vybrané peptide dosahuje jednotek fmol v 10 µl plazmy
- Linearita odezvy pro objem vzorku od 10 µl do 150 µl vykazuje R2 vyšší než 0,999
- Celkové koeficienty variability workflow (digesce, obohacení, MS) jsou nižší než 5 %
- Porovnání měření soluble transferrin receptor se srovnávací referenční metodou prokázalo korelaci R2 = 0,998
- Pracovní postup trvá přibližně 4 hodiny pro zpracování 96 vzorků a 3 minuty LC/MS analýzy na vzorek

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká propustnost a nízká spotřeba vzorku vhodná pro preklinické ověřování biomarkerů
• Možnost multiplexního měření více proteinů v jedné dávce s vysokou přesností
• Reprodukovatelnost a robustnost ideální pro rutinní klinickou a QA/QC laboratoř

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s ultrarychlými systémy jako RapidFire pro cykly kolem 10 sekund
• Expanze počtu měřených peptidů a adaptace na různé biologické matrice
• Implementace do klinického provozu pro rutinní kvantifikaci biomarkerů

Závěr

Automatizovaný addition only postup tryptické digesce a SISCAPA obohacení na platformě Agilent Bravo poskytuje vysokou citlivost, linearitu a opakovatelnost analýzy plazmatických proteinů. Díky plné automatizaci, rychlému LC/MS a nízké variabilitě je metoda připravena pro široké využití v klinické, průmyslové i výzkumné oblasti.

Reference

1. Rittenberg D Foster GL novy postup pro kvantitativni analyzu metodou izotopove dilution aplikace na stanovení aminokyselin a mastnych kyselin J Biol Chem 1940 133 737 774
2. Anderson et al Mass spectrometric quantitation of peptides and proteins using Stable Isotope Standards and Capture by Anti Peptide Antibodies SISCAPA J Proteome Res 2004 3 235 244
3. Anderson et al High Throughput SISCAPA Based Peptide Quantitation Using an Agilent RapidFire High Throughput Mass Spectrometry System Agilent Application Note 5991 0380EN 2014