Improving the Detection of Thyroglobulin in Human Plasma for Clinical Research by Combining SISCAPA Enrichment and Microflow LC-MS

Význam tématu

Detekce tyreoglobulinu (Tg) v lidské plazmě je klíčová pro sledování štítné žlázy a vyhledávání klinických biomarkerů. Běžné imunotesty mohou vykazovat falešně negativní výsledky vlivem endogenních protilátek proti Tg. Metody kombinující stabilní izotopové standardy a SISCAPA obohacení s LC-MS nabízejí vyšší selektivitu a citlivost, ale vyžadují velké objemy vzorku. HTML IonKey/MS systém s mikroflow kapalinovou chromatografií a dvoupumpovým trappingem umožňuje snížit objem plazmy a zachovat vysokou citlivost a přesnost měření.

Cíle a přehled studie

Studie si klade za cíl ověřit, zda konfigurace IonKey/MS s dvoupumpovým trappingem a SISCAPA obohacením dosahuje srovnatelných nebo lepších analytických parametrů než publikované standardní LC-MS postupy při použití menšího objemu plazmy. Hlavními parametry jsou dolní mez kvantifikace (LLOQ), lineární rozsah, přesnost, přesnost opakování a průběh analytického cyklu.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky byly nejprve proteolyticky štěpeny trypsinem včetně autoprotilátek. Následovalo selektivní obohacení proteotypického FSP peptidu antigenními protilátkami konjugovanými na magnetické částice s přidaným stabilním izotopovým standardem. Eluát byl analyzován mikroflow LC-MS na IonKey/MS systému v konfiguraci s dvoupumpovým trappingem. Hlavní přístroje a komponenty:

• ACQUITY UPLC M-Class System s iKey Peptide BEH C18 a Symmetry C18 Trap
• IonKey/MS System s dvěma binárními čerpadly
• Xevo TQ-S ve MRM režimu
• Software MassLynx 4.1 a TargetLynx

Hlavní výsledky a diskuse

1. Na syntetických standardech FSP byla prokázána lineární odpověď od 0,64 do 2000 amol/µl s CV do 16 % při 13 amol.
2. Při titraci lidské plazmy bylo možné spolehlivě měřit Tg při použití pouze 40 µl plazmy s lineární závislostí PAR hodnot.
3. Porovnání s Agilent 1290/6490 standard flow ukázalo vysokou korelaci (R2 = 0,998) a lepší opakovatelnost měření u IonKey/MS (CV 6–14 % vs. 9–36 %).
4. LLOD stanoveno na 15 amol na kolonu, LLOQ na 45 amol na kolonu. Celkový LLOQ pro protein bylo ~1,52 amol/µl (1 ng/ml) z 50 µl plazmy.

Přínosy a praktické využití metody

• Desetkrát menší objem vzorku plazmy než u standardních postupů
• Cyklický čas analýzy 6,75 min
• Vyšší citlivost a přesnost měření
• Nižší spotřeba organických rozpouštědel

Budoucí trendy a možnosti využití

Metoda může být rozšířena na další nízkomolekulární a proteinové biomarkery s nízkou koncentrací. Očekává se integrace s plně automatizovanou přípravou vzorků, využití v klinických studiích i rutinní QA/QC a rozšíření na multiplexní analýzy.

Závěr

Konfigurace IonKey/MS s dvoupumpovým trappingem a SISCAPA obohacením umožňuje subnanogramovou kvantifikaci tyreoglobulinu s vynikající přesností a opakovatelností pomocí minimalizovaného objemu plazmy a krátkého analytického cyklu. Metoda představuje perspektivní alternativu k tradičním standardním LC-MS a imunotestům v klinickém výzkumu.

Reference

1. Lame M.E., Chambers E.E. Improving a High Sensitivity Assay for the Quantification of Teriparatide in Human Plasma Using the ionKey/MS System. Waters Application Note, 720004948EN, 2015.