Jet Stream Proteomics for Sensitive and Robust Standard Flow LC/MS

Význam tématu

Proteomika je klíčová oblast biochemie a medicíny sloužící k identifikaci a kvantifikaci proteinů v biologických vzorcích. Tradičně se pro maximální citlivost využívaly nanoflow LC/MS systémy, které díky malým kapilárám a nízké rychlosti přinášejí vysokou ionizační účinnost. Provoz a údržba nanoflow systémů je však náročná a méně robustní. Standardní proudové UHPLC nabízí odolnější a rutinní provoz s vyšší kapacitou vzorku, ale dříve mělo omezenou citlivost pro proteomiku. Metoda Jet Stream proteomics mění tento stav použitím iFunnel technologie ve spojení se standardním UHPLC, čímž umožňuje vysokou citlivost, reprodukovatelnost a robustnost analýzy i bez nanoflow režimu.

Cíle a přehled studie

Studie představuje technický popis technologie Jet Stream proteomics, která kombinuje Agilent Jet Stream termální gradientní soustředění a iFunnel dvojstupňový iontový kompaktor pro zvýšení účinnosti ESI a zachycení většího podílu iontů. Cílem je porovnat citlivost a robustnost standardního toku LC/MS oproti nanoflow, demonstrovat aplikační možnosti v cílené kvantitativní proteomice MRM i ve výzkumné proteomice s Q-TOF. Autory jsou vědci z Agilent Technologies, kteří popisují principy, experimentální výsledky a praktické přínosy.

Použitá metodika a instrumentace

Analýzy byly provedeny na systému Agilent 1290 Infinity UHPLC spojeném s:

• Zdroj Agilent Jet Stream se superhorkým dusíkem pro lepší desolvataci a soustředění spreje
• iFunnel dvojstupňový iontový kompaktor (hexabore kapilára, vysokotlaký a nízkotlaký funnel)
• Mass spektrometry Agilent 6495 Triple Quadrupole a 6550 iFunnel Q-TOF
• Kolony Agilent AdvanceBio Peptide Mapping 2.1 × 250 mm
• Metody MRM pro kvantitativní analýzu proteinových biomarkerů
• Databázové vyhledávání a validace pomocí Agilent Spectrum Mill při 1–1,2 % FDR

Hlavní výsledky a diskuse

1. Citlivost a masově závislá odezva

• Jet Stream s iFunnel dosahuje 5–10× vyšší signálu a lepší S/N než konvenční ESI.
• Při masově závislé odezvě lze použít 2,1 mm kolony s nižším tokem bez ztráty citlivosti, díky čemuž lze na-column naložit až 10× více vzorku.

2. Cílená kvantifikace (MRM)

• Pro lidskou plasmu bylo pro 72/81 peptidů dosaženo stejné nebo lepší citlivosti standardního toku s Jet Stream oproti nanoflow.
• LLOQ 5 amol pro peptid LVNEVTEFAK s dynamickým rozsahem 6 řádů.
• Retenční časy stabilní (<1,5 % RSD po 3,5 týdnech).

3. Objevná proteomika (Q-TOF)

• Při gradientu 120 min identifikováno ~1 200 proteinů z E. coli s validací >60 % MS/MS spekter.
• Delší gradienty a vyšší naložení vzorku zvyšují počet identifikací, ale s menším přírůstkem než u nanoflow.
• V buněčné linii MDA-MB-231 bylo v triplikátu identifikováno 5 905 proteinů a 32 446 peptidů s výbornou reprodukovatelností.
• Dvousložitá analýza (high-pH frakcionace + UHPLC) v 40 h LC/MS přinesla 13 650 unikátních proteinů ze dvou lidských buněčných linií.

Přínosy a praktické využití metody

• Robustní a snadněji udržovatelná platforma oproti nanoflow LC/MS.
• Vyšší kapacita kolony a možnost analýzy komplexních vzorků s rutinní reproducibilitou.
• Vhodné pro vysoce citlivou cílenou kvantifikaci biomarkerů v klinických a QA/QC laboratořích.
• Možnost rychlých a vysoce průtokových proteomických workflow.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Dále zlepšovat iontový přenos a masově závislou citlivost zdrojů.
• Integrace s automatizovanou frakcionací pro hlubší proteomické prozkoumání.
• Aplikace v rutinní klinické diagnostice a vysokopropustné screeningové proteomice.
• Vývoj metod pro PTM analýzu (např. fosfoproteiny) s vysokou citlivostí.

Závěr

Jet Stream proteomics významně rozšiřuje možnosti standardního toku LC/MS v proteomice. Kombinace termálního soustředění, iFunnel technologie a vysoce výkonných UHPLC/MS systémů umožňuje rutinní, robustní a vysoce citlivé analýzy bez komplikací nanoflow provozu. Metoda je aplikovatelná jak pro cílenou kvantifikaci biomarkerů, tak pro objevnou proteomiku, zrychluje workflow a nabízí výbornou reprodukovatelnost v dlouhodobém měřítku.

Reference

1. Agilent Jet Stream Thermal Gradient Focusing Technology, Agilent Technologies, publication number 5990-3494EN.
2. iFunnel Technology for Enhanced Sensitivity in Tandem LC/MS, Agilent Technologies, publication number 5990-5891EN.
3. Love C., Miller C. A., Mordehai A., Using Thermal Gradient Focusing ESI to Develop Sensitive, High-Throughput Capillary Flow LC/MS/MS Peptide Quantitation Assays, ASMS 2011 poster ThP-475.
4. van de Goor T., Buckenmaier S., Dittman M. Rethinking the Proteomics Experiment for LC/MS - Scaling for Optimal Results, ASMS 2014 poster TP-192.
5. Buckenmaier S. et al., Instrument contributions to resolution and sensitivity in ultra high performance liquid chromatography using small bore columns: Comparison of diode array and triple quadrupole mass spectrometry detection, J. Chromatogr. A 2015, 1377, pp. 64-74.
6. Percy A. J. et al., Comparison of standard- and nano-flow liquid chromatography platforms for MRM-based quantitation of putative plasma biomarker proteins, Anal. Bioanal. Chem. 2012, 404(4), pp. 1089-1101.
7. The 6490 Triple Quad LC/MS Enables the Highest Sensitivity for Peptide Quantitation in Plasma, Agilent Technologies, publication number 5990-6513EN.
8. Domanski D. et al., High-flow multiplexed MRM-based analysis of proteins in human plasma without depletion or enrichment, Clin. Lab. Med. 2011, 31(3), pp. 371-384.
9. Wang Y. et al., Reversed-phase chromatography with multiple fraction concatenation strategy for proteome profiling of human MCF10A cells, Proteomics 2011, 11, pp. 2019-2026.