Determination of Triphenylmethane Dyes and Their Metabolites in Shrimp Using QuEChERS Extraction and the ACQUITY UPLC H-Class System with Xevo TQD

Význam tématu

Monitoring barviv triphenylmethanové řady, jako jsou malachitová zeleň, krystalová violeť či brilantní zeleň a jejich bezbarvé leukoformy, je klíčovým krokem ke zjištění jejich přítomnosti v mořských plodech. Tyto látky jsou účinné antimykotika a antiparazitika, ale zároveň potenciálně mutagenní a nezaznamenané jako registrované veterinární přípravky. Přetrvávající rezidua v akvakulturních produktech mohou ohrozit spotřebitele a porušují mezinárodní limity stanovené regulačními orgány.

Cíle a přehled studie

Studie představuje rychlou a citlivou metodiku pro simultánní stanovení tří hlavních TPM barviv (MG, CV, BG) a jejich metabolitů (LMG, LCV) v krevetách. Cílem bylo vyvinout jednodušší alternativu ke klasickým extrakcím a SPE úpravám vzorku, která odpovídá MRPL EU a FDA požadavkům.

Použitá instrumentace

• ACQUITY UPLC H-Class System
• ACQUITY UPLC BEH C18 kolona (2,1×100 mm, 1,7 µm)
• Xevo TQD hmotnostní spektrometr
• DisQuE QuEChERS Pouch (sodium acetate, magnesium sulfate)
• DisQuE QuEChERS PSA Tube (PSA, C18, MgSO4)

Použitá metodika

Vzorky krevet byly homogenizovány a 10 g hmoty extrahováno 10 mL acetonitrilu s 1 % kyselinou octovou. Přidáním QuEChERS pouch se směs promíchala, sonikovala a odstředila. Pročištění proběhlo v PSA tubě obsahující MgSO4, primární sekundární amin a C18. Následně byly vzorky injektovány (5 µL) do UPLC systému s gradientním elučním protokolem vody s octanem amonným (pH 4) a acetonitrilem. Detekce probíhala v režimu MRM s pozitivní elektrospray ionizací.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosáhla lineární odezvy pro rozsahy 0,05–40 ppb (R2 > 0,998) bez koncentračního kroku. Matrixové efekty byly minimální (sklon poměru 0,95–1,19). Meze detekce a kvantifikace byly nižší než 1 µg/kg, splňující limity EU MRPL i FDA. Použití deuterovaných interních standardů pro LMG a LCV zlepšilo recoverie na 104–106 %, zatímco u ostatních barviv se zde uváděly nižší hodnoty, ovšem dostatečné pro kvantifikaci díky vysoké citlivosti MS.

Přínosy a praktické využití metody

Navržená kombinace upraveného QuEChERS protokolu a UPLC–MS/MS přináší:

• zkrácený čas analýzy (6 min běh chromatografu)
• jednodušší přípravu vzorků bez vícenásobných SPE kroků
• vysokou citlivost a selektivitu detekce
• snížení provozních nákladů a zvýšení propustnosti laboratoře

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj může směřovat k:

• rozšíření metody na další druhy akvakulturních produktů (ryby, škeble)
• automatizaci extrakčních kroků pomocí robotických systémů
• využití vysokorozlišovací MS pro neznámé kontaminanty
• multiplexním screeningovým protokolům pro širší spektrum veterinárních látek

Závěr

Popsaná metodika nabízí efektivní a validní postup pro monitoring TPM barviv v krevetách, splňuje mezinárodní regulační požadavky a současně zvyšuje efektivitu laboratorní práce.

Reference

1. Bergwerff AA, Scherpenisse P. J Chromatogr B Anal Technol Biomed Life Sci. 788:351–359, 2003.
2. European Commission Decision 2002/657/EC of 12 August 2002, Official Journal of the European Communities L 221, 17.08.2002, p. 8–36.
3. López-Gutierrez R, Pardo O, et al. Anal Methods. 5:3434–3449, 2013.
4. Hashimoto JC, Burgess JE, Brady EA. J AOAC Int. 95:913–922, 2012.
5. Kaplan M, et al. J Chromatogr A. 1349:37–43, 2014.
6. Hurtado-Pessel D, et al. J AOAC Int. 96:1152–1157, 2013.