Improving the Recovery of Intact Antibodies from Reversed-Phase Separations Using a BioResolve RP mAb Polyphenyl Column

Význam tématu

Monoklonální protilátky (mAb) následkem své velké molekulové hmotnosti a strukturní heterogenity vyžadují vysoce účinné analytické metody k ověření kvality a stability. RPLC je díky své flexibilitě a rozlišovací schopnosti široce využívána v charakterizaci bílkovin, ale standardní metody často vyžadují vysoké teploty a agresivní iontově párovací činidla, což může vést k degradaci vzorků a zkrácení životnosti kolony.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo ukázat, že použitím BioResolve RP mAb Polyphenyl Column lze při nižších kolonkách teplotách (40–70 °C) dosáhnout vysoké návratnosti intaktních protilátek. Pro porovnání byly nasazeny oba přístupy: standardní polymerní kolona s agresivním činidlem TFA a nově optimalizovaný systém s DFA a n-butanolem.

Použitá metodika

Gradientní RPLC analýza intact mAb se sledováním UV detekce při 280 nm. Rozpouštědla: voda a acetonitril s 0,1 % TFA nebo s 0,1 % DFA a 5 % n-butanolu. Teplotní rozmezí kolony 40–80 °C. Vzorky: Intact mAb Mass Check Standard, Rituximab, Tocilizumab, Bevacizumab, 2,5 μg na injekci.

Použitá instrumentace

• ACQUITY UPLC H-Class Bio System
• ACQUITY UPLC Tunable UV Detector, 5 mm kyveta, λ = 280 nm
• BioResolve RP mAb Polyphenyl Column, 450 Å, 2,7 μm, 2,1 × 50 mm
• Polymeric PS-DVB Column, 1500 Å, 2,1 × 50 mm
• Empower 3 Software

Hlavní výsledky a diskuse

• Rozlišení na BioResolve kolonce při 80 °C s TFA umožnilo detekci nečistot, ale při teplotách pod 70 °C klesla obnova téměř na nulu.
• Přidání DFA a 5 % n-butanolu stabilizovalo desorpci a udrželo retenci, výsledkem byla nad 90 % obnova až do 60 °C.
• Metoda vykázala lepší rozlišení menších nečistot při středních teplotách kolem 60 °C.
• BioResolve kolona dosahuje s optimalizovanými podmínkami srovnatelné či lepší obnovy než benchmarková polymerní kolona u všech testovaných mAb.

Přínosy a praktické využití metody

Výsledná metoda minimalizuje riziko termické degradace vzorku, prodlužuje životnost kolony a zjednodušuje workflow ve výzkumu i v QC laboratořích biopharma průmyslu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Počítá se s dalším vývojem povrchových ligandů pro snížení nežádoucích interakcí, integrací s MS detekcí pro detailnější charakterizaci heterogenity, automatizací teplotních modulů a rozšířením na subunit a peptidové analýzy.

Závěr

BioResolve RP mAb Polyphenyl Column v kombinaci s DFA a n-butanolem umožňuje vysoce efektivní separaci intaktních protilátek při nižších teplotách, s vynikající obnovou a rozlišením, což podporuje přesnější a šetrnější analytické metody.

Reference

1. Liu JKH The history of monoclonal antibody development–progress, remaining challenges and future innovations Ann Med Surg 2014 3 113–116
2. Dong M et al HPLC for characterization and quality control of therapeutic monoclonal antibodies LCGC North America 2014 32 10 796–808
3. Fekete D et al Impact of mobile phase temperature on recovery and stability of monoclonal antibodies using recent reversed-phase stationary phases J Sep Sci 2012 35 3113–3123
4. Nguyen J et al Designing a new particle technology for reversed phase protein separations Waters Application Note 720006168EN 2018
5. Nguyen J et al A novel phenyl bonded phase for improved protein reversed phase separation Waters Application Note 720006169EN 2018
6. Bondarenko PV et al Optimization of a reversed-phase LC/MS method for characterizing recombinant antibody heterogeneity and stability J Chromatogr A 2006 1120 112–120