Protein Quantification in Formulation Buffer Using a BioResolve RP mAb Polyphenyl Column

Význam tématu

Proteinová kvantifikace v přítomnosti excipientů, jako jsou histidin a rekombinantní lidský sérový albumin, je nezbytná pro spolehlivou kontrolu kvality biotechnologických léčiv. Tradiční měření UV absorbance při 280 nm může být ovlivněno složením formulace, což vyžaduje chromatografické přístupy schopné separovat cílový protein od zásobního proteinu a pufru.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat použití kolony BioResolve RP mAb Polyphenyl ve spojení s UPLC systémem pro rychlou a přesnou kvantifikaci čtyř terapeutických proteinů (rituximab, interleukin-12, erytropoetin, abatacept) v přítomnosti histidinového pufru a rekombinantního lidského albuminu. Studie se zaměřila na lineární dynamické rozmezí, přesnost, rychlost separace a mezivzorkové přenosy.

Použitá metodika a instrumentace

Pro separaci byla použita kolona BioResolve RP mAb Polyphenyl (2,7 µm, 450 Å, 2,1×50 mm) na systému ACQUITY UPLC H-Class Bio s detektorem TUV (280 nm). Mobilní fáze A i B obsahovaly 0,1 % TFA ve vodě či acetonitrilu. Gradienty a průtoky se lišily podle analyzovaného proteinu (0,2–1,8 mL/min; teploty 60–80 °C). Data byla zpracována v softwaru Empower 3.

Hlavní výsledky a diskuse

Interleukin-12 byl oddělen od rHSA za méně než 4 minuty s rozlišením 3,5, dvě lineární oblasti (0,01–0,1 µg a 0,1–2 µg) s korelačním koeficientem >0,999 a chybou <8 %. Zvýšený průtok 1,8 mL/min umožnil separaci pod 1 minutu při zachování kvality a chybě <10 %. Erytropoetin vykázal rozlišení >5, lineární rozsah 0,5–10 µg (R2=0,9999), chyba <3 % a bez detekovatelného carryover. Abatacept (0,2–5 µg, R2=0,9999) měl chybu <3 % i při částečném překryvu se špičkou rHSA. Rituximab (0,1–5 µg, R2=0,9993) vyžadoval 80 °C, separace trvala do 10 minut, chyba <12 % a žádné zbytky.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a robustní separace terapeutických proteinů od excipientů.
• Široké lineární dynamické rozsahy a vynikající linearita (R2 ≥0,997).
• Nízké mezivzorkové přenosy (carryover ≤0,11 %).
• Vhodné pro rutinní kontrolu kvality a vysokoprůchodovou analýzu.

Budoucí trendy a možnosti využití

S rozvojem pevných jaderných částic lze očekávat další zrychlování analýz bez kompromisu rozlišení. Integrace s hmotnostní spektrometrií a využití alternativních afinitních stanicionárních fází rozšíří schopnosti selektivní kvantifikace v komplexních matricích. Výhledově lze kombinovat metodiky RP-LC s IMAC pro přímé sledování konsolidace proteinových drug substance.

Závěr

BioResolve RP mAb Polyphenyl kolona na UPLC systému prokázala vysokou efektivitu a přesnost kvantifikace různých terapeutických proteinů v běžných formulacích obsahujících histidin a rHSA. Metoda nabízí rychlé rozdělení, široké dynamické rozsahy, nízkou chybovost a minimální carryover, což ji činí vhodnou pro rutinní QA/QC v oblasti biotechnologických léčiv.

Reference

• Nguyen JM a kol. Designing a new particle technology for reversed-phase separations of proteins. Waters Application Note, 720006168EN, 2018.
• Nguyen JM a kol. A Novel Phenyl-Based RPLC Stationary Phase for High Throughput, High Resolution Characterization of Protein Therapeutics. Waters Application Note, 720006169EN, 2018.
• Zbacnik TJ a kol. Role of buffers in protein formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences, 2017, 106, 713–733.
• Human Serum Albumin as a Pharmaceutical Excipient. Drug Development and Delivery, 2016.
• Hamza T a kol. Interleukin 12 a key immunoregulatory cytokine in infection applications. International Journal of Molecular Sciences, 2010, 11, 789–806.
• Erythropoietin. Wikipedia, 2023.
• Abatacept. Wikipedia, 2023.
• Rituximab. Wikipedia, 2023.