HIGH SENSITIVITY LC-MS PROFILING OF ANTIBODY DRUG CONJUGATES WITH DIFLUOROACETIC ACID ION PAIRING AND A HIGH-COVERAGE PHENYL-BONDED STATIONARY PHASE

Význam tématu

Proteinová reverzní fázová chromatografie s LC-MS je zásadní pro komplexní charakterizaci monoklonálních protilátek a jejich konjugátů (ADC). Vysoká citlivost a rozlišení umožňují detailní analýzu proteoform, určení DAR a sledování modifikací s klíčovým dopadem na účinnost a bezpečnost terapeutik.

Cíle a přehled studie

Tato práce si klade za cíl vyvinout robustní LC-UV-MS metodu pro profilování subjednotek mAb a ADC s použitím vysoce čisté difluorooctové kyseliny (DFA) jako iontového páru a novelní fenylově vázané stacionární fáze. Studie zahrnuje purifikaci DFA, optimalizaci chromatografických podmínek a ověření metodiky na různých ADC vzorcích.

Použitá metodika

Vzorky: NIST mAb standard, komerční a proprietární ADC. Preparace: IdeS digest a redukce.
Chromatografie: ACQUITY UPLC H-Class/H-Class Bio s BioResolve RP mAb Polyphenyl (2.7 µm, 2.1 × 50 mm) nebo ACQUITY BEH C4 (1.7 µm, 2.1 × 150 mm).
Detekce: UV při 280 nm, Xevo G2-XS QToF LC/MS v módě citlivosti, dekonvoluce MaxEnt.
Podmínky: mobilní fáze A (0.1–0.15 % DFA), B (ACN/IPA), gradient 15–55 % v 20 min, teplota 70–80 °C, průtok 0.2–0.6 mL/min.

Použitá instrumentace

• ACQUITY UPLC H-Class a H-Class Bio
• TUV/PDA detektor
• MassLynx 4.1 a UNIFI 1.8
• Xevo G2-XS QToF
• BioResolve RP mAb Polyphenyl a ACQUITY BEH C4 kolony

Hlavní výsledky a diskuse

DFA oproti TFA poskytuje až 4násobné zvýšení MS signálu a lepší chromatografické rozlišení i vyšší proteinové recoveries. Metoda dosahuje méně než 2 Da odchylku v hmotnostním měření a méně než 6 % RSD při robustnostních testech (teplota, dávka, průtok, šarže stacionární fáze, šarže DFA, systémy). Aplikace na různé ADC modely potvrdila spolehlivost výpočtu DAR a možnost optimalizace parametrů pro vysoce hydrofobní vzorky.

Přínosy a praktické využití

Metoda umožňuje rychlé a citlivé LC-MS profilování mAb a ADC pro výzkum, vývoj a QA/QC. Vysoká reproducibilita a robustnost napomáhají agilnímu ladění analytických metod v průmyslových laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj může zahrnovat širší nasazení MS-kompatibilních sloučenin, automatizované platformy, rozšíření na další modifikace proteinu a aplikace v klinických studiích.

Závěr

Vyvinutá LC-UV-MS metoda s čistou DFA a fenylovou stacionární fází nabízí vylepšenou citlivost, rozlišení a robustnost pro subjednotkové profilování mAb a ADC. Je vhodná pro rutinní i výzkumné nasazení v analytické chemii biofarmaceutik.

Reference

• Smith J., Friese O., Rouse J., Nguyen J., Lauber M., Jayaraman P. Characterization of Hydrophobic Monoclonal Antibodies and Antibody Drug Conjugates. WCBP 2018.
• Nguyen J. M. et al. Designing a New Particle Technology for Reversed Phase Separations of Proteins. Waters Application Note 720006168EN, 2018.
• Nguyen J. M., Kizekai L., Walsh D., Cook J., Lauber M. A Novel Phenyl Bonded Phase for Improved Reversed-Phase Separations of Proteins. Waters Application Note 720006169EN, 2018.