A Novel Phenyl Bonded Phase for Improved Reversed-Phase Separations of Proteins

Význam tématu

Reverzní fázová kapalinová chromatografie je klíčová pro charakterizaci monoklonálních protilátek a dalších proteinových terapeutik. Její vysoké rozlišení a kompatibilita s hmotnostní spektrometrií umožňují detailní analýzu mikroheterogenity bílkovin. Výzvou zůstává optimalizace povrchové chemie stacionární fáze pro minimalizaci sekundárních interakcí, zvýšení retence a snížení carryover.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout novou křemelinu upravenou polyfenylovým ligandem na pevném jádru o pórech 450 Å s vysokou pokrytím fenylovými skupinami. Studie porovnávala BioResolve RP mAb Polyphenyl kolonu s běžnými C4, phenyl a polyDVB fázemi v různých iontově párujících podmínkách a při nižších teplotách separace.

Použitá instrumentace

• ACQUITY UPLC H-Class Bio System
• MassLynx 4.1
• UNIFI 1.8

Použitá metodika

Vzorky: NIST mAb Subunit Standard po IdeS digestu, intact mAb Mass Check Standard a infliximab. Kolony: BioResolve RP mAb Polyphenyl (450 Å, 2.7 µm) a komparativní C4, phenyl a polyDVB fáze. Eluce v gradientu s mobilními fázemi modifikovanými 0.1 % TFA nebo FA, teploty 30–90 °C, průtok 0.2–1.4 mL/min, nálože 1 µg. Výpočty efektivní kapacity špiček, procentuálního carryover a test stability v 0.5 % TFA při 60 °C.

Hlavní výsledky a diskuse

BioResolve RP mAb Polyphenyl kolona prokázala o 13–50 % vyšší efektivní kapacitu než srovnávané fáze pod podmínkami 0.1 % TFA i FA. Nabízí lepší selektivitu pro lysinové varianty Fc/2, minimalizuje carryover (nebylo detekováno), vykazuje vynikající odolnost vůči kyselinám (pouze 20 % ztráty retence po 21 h v 0.5 % TFA) a umožňuje separace při 50–70 °C. Snížení koncentrace TFA na 0.05 % při 65 °C zachovává rozlišení a omezuje degradační nečistoty.

Přínosy a praktické využití metody

Nová polyfenylová kolona umožňuje detailnější profilaci protilátek, snižuje dobu analýzy a frekvenci výměny stacionární fáze, je kompatibilní s LC–MS a odolná vůči agresivním podmínkám.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření aplikací na další biologické makromolekuly, optimalizace ligandových modifikací pro specifické proteiny a integrace s pokročilými MS technikami pro vyšší throughput a automatizaci.

Závěr

BioResolve RP mAb Polyphenyl kolona představuje významný pokrok v RPLC analýze proteinů díky kombinaci vysoké rozlišovací schopnosti, stability a flexibility provozních podmínek.

Reference

1. Bobály B.; Sipkó E.; Fekete S. Challenges in liquid chromatographic characterization of proteins. J. Chromatogr. B. 2016, 1032, 3–22.
2. Ren D.; Pipes G. D.; Hambly D. M.; Bondarenko P. V.; Treuheit M. J.; Brems D. N.; Gadgil H. S. Reversed-phase liquid chromatography of immunoglobulin G molecules and their fragments with the diphenyl column. J. Chromatogr. A. 2007, 1175, 63–68.
3. Nguyen J. M.; Rzewuski S.; Walsh D.; Cook D.; Izzo G.; DeLoffi M.; Lauber M. A. Designing a New Particle Technology for Reversed Phase Separations of Proteins. Waters Application Note 720006168EN, 2018.
4. Ren D.; Pipes G. D.; Xiao G.; Kleemann G. R.; Bondarenko P. V.; Treuheit M. J.; Gadgil H. S. Reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry of site specific chemical modifications in intact immunoglobulin molecules and their fragments. J. Chromatogr. A. 2008, 1179, 198–204.
5. Trammell B. C.; Boissel C. A.; Carignan C.; O’Shea D. J.; Hudalla C. J.; Neue U. D.; Iraneta P. C. Development of an accelerated low-pH reversed-phase liquid chromatography column stability test. J. Chromatogr. A. 2004, 1060, 153–163.
6. Faid V.; Leblanc Y.; Bihoreau N.; Chevreux G. Middle-up analysis of monoclonal antibodies after combined IgdE and IdeS hinge proteolysis: Investigation of free sulfhydryls. J. Pharm. Biomed. Anal. 2018, 149, 541–546.
7. Schiel J. E.; Davis D. L.; Borisov O. V. State-of-the-Art and Emerging Technologies for Therapeutic Monoclonal Antibody Characterization Volume 2. Biopharmaceutical Characterization: The NISTmAb Case Study; American Chemical Society, 2015.
8. Ranbaduge N.; Shion H.; Lauber M. A.; Yu Y. LC–MS Characterization of mAb Subunits Using a BioResolve RP mAb Column. Waters Technology Brief 720006199EN, 2018.