Vytváření vlastních MS/MS knihoven v NIST26 pro relevantnější identifikaci sloučenin

Komerční a veřejné spektrální knihovny poskytují široké pokrytí pro identifikaci pomocí LC-MS/MS, nemohou však obsahovat všechny sloučeniny důležité pro konkrétní laboratoř. Příslušné produkty, metabolity, meziprodukty, nečistoty, degradační produkty, biomarkery nebo interně charakterizované látky mohou mít zásadní význam, i když ve standardních referenčních knihovnách chybějí. NIST26 umožňuje laboratořím vytvářet vlastní uživatelské MS/MS knihovny a přímo je začlenit do rutinních vyhledávacích postupů, čímž vzniká cílený zdroj přizpůsobený konkrétním analytickým potřebám.

Proč vytvářet vlastní MS/MS knihovnu?

Uživatelské knihovny jsou obvykle výrazně menší než komerční nebo veřejné spektrální databáze, jejich hodnota však není dána pouze počtem záznamů.

Knihovna vytvořená pro konkrétní laboratoř může obsahovat právě ty sloučeniny, které jsou pro danou aplikaci nejdůležitější. Patřit mezi ně mohou:

• proprietární produkty,
• známé metabolity,
• syntetické meziprodukty,
• nečistoty,
• degradační produkty,
• biomarkery,
• sloučeniny související se specifickými průmyslovými nebo environmentálními vzorky.

Takové knihovny proto mohou poskytovat velmi relevantní identifikace při farmaceutickém vývoji, průmyslovém výzkumu a vývoji, v medicínských laboratořích, environmentální analýze i dalších specializovaných oblastech. Relativně malá kolekce pečlivě charakterizovaných sloučenin může být pro konkrétní laboratoř užitečnější než mnohem rozsáhlejší obecná databáze.

Jaké informace lze uložit ke každému spektru?

Vytvoření kvalitního knihovního záznamu zahrnuje více než pouze import MS/MS spektra.

Kompletní záznam může kombinovat několik typů informací, například:

• experimentální spektrum,
• chemickou strukturu,
• parametry přístroje,
• informace o ionizaci,
• historii vzorku,
• další uživatelsky definovaná metadata.

Spektra lze přenést ze softwaru výrobce přístroje do NIST Library Search nebo je lze odeslat z karty Chromatogram přímo do prostředí Library Search v NIST26. Chemické struktury lze importovat prostřednictvím schránky Windows z programu pro kreslení chemických struktur, zatímco standardní experimentální parametry a informace o historii vzorku lze připravit samostatně a následně přidat k záznamu.

Možnost uchovávat analytická metadata společně se spektrem je důležitá zejména u interně vytvářených knihoven, protože zachovává kontext, ve kterém bylo referenční spektrum získáno.

Využití tagů pro organizaci LC-MS/MS metadat

NIST26 podporuje řadu strukturovaných tagů pro LC-MS/MS spektra.

Pomocí nich lze popsat například:

• typ spektra,
• typ sloučeniny,
• název iontu,
• typ prekurzoru,
• m/z prekurzoru,
• kolizní energii,
• typ přístroje,
• identifikátor vzorku,
• způsob ionizace,
• polaritu ionizace,
• kolizní plyn,
• tlak,
• hmotnostní rozsah,
• maximální intenzitu,
• napětí na konusu,
• náboj,
• molekulovou hmotnost,
• známé nečistoty,
• související čísla CAS,
• sekvenci peptidu a jeho modifikace.

Jde o praktický způsob, jak ke spektrům připojit prohledávatelné a standardizované experimentální informace namísto ukládání všech metadat pouze do nestrukturovaného pole komentářů.

Tagy lze zadávat jednotlivě prostřednictvím sekce Additional Info v rozhraní Librarian. Při přidávání většího počtu spekter však může být výrazně rychlejší jejich hromadné zadávání.

Efektivní přidávání skupin tagů

U opakujících se workflow lze metadata připravit předem a do NIST26 je vložit jako skupinu.

Doporučeným postupem je uchovávat často používané sady tagů v jednoduchém textovém souboru, následně je zkopírovat do pole synonym a pomocí funkce Add to List je převést na strukturované informace.

To je výhodné zejména tehdy, pokud software výrobce přístroje některé parametry přenáší automaticky. Uživatel pak může doplnit pouze chybějící informace, například iontový adukt nebo polaritu, a nemusí znovu zadávat metadata, která byla již importována společně se spektrem.

Je však nutné dávat pozor na duplicitní záznamy. Pokud už informace v knihovním záznamu existuje a je přidána znovu, mohou vzniknout duplicitní metadata.

Tento způsob práce může výrazně urychlit vytváření knihovny v případech, kdy více spekter sdílí stejnou konfiguraci přístroje nebo stejné akviziční parametry.

Uchování historie vzorku

Spektrální shoda má větší informační hodnotu, pokud je znám původ referenčního spektra.

NIST26 proto umožňuje ukládat podrobné informace o vzorku do pole komentářů. U skupin souvisejících vzorků lze text připravit v programu Poznámkový blok nebo jiném textovém editoru a následně jej vložit do více záznamů.

Mezi užitečné informace mohou patřit například:

• místo odběru,
• datum a čas odběru,
• jméno analytika,
• organizace,
• interní identifikátor vzorku,
• informace o projektu,
• další relevantní kontext.

V environmentálních, klinických, farmaceutických a průmyslových laboratořích se tyto informace mohou stát důležitou součástí trasovatelnosti dat.

Přidávání molekulových struktur

Uživatelská knihovna získává výrazně vyšší hodnotu, pokud jsou jednotlivá spektra propojena s molekulovými strukturami.

Strukturu lze nakreslit od začátku v programu pro kreslení chemických struktur. Alternativně je možné v NIST Search najít podobnou strukturu, odeslat ji do výchozího editoru struktur a následně ji podle potřeby upravit.

Hotovou strukturu lze zkopírovat do schránky Windows a vložit do okna s informacemi o spektru v NIST Librarian. NIST26 poté může z importované struktury vypočítat molekulový vzorec a molekulovou hmotnost.

Propojení spektra s chemickou strukturou umožňuje informativnější zobrazení knihovních záznamů a podporuje také vyhledávání podle struktury.

Vytváření vlastních uživatelských tagů

Kromě standardních LC-MS/MS tagů si mohou laboratoře definovat také vlastní metadata.

Příklady zahrnují například:

• chemika,
• číslo laboratorního deníku,
• analytika.

Informace lze připravit v textovém editoru a přidat pomocí odpovídající syntaxe tagů. Po nastavení v nabídce Comment Field Display se tyto údaje zobrazí jako samostatné strukturované položky, nikoli pouze jako součást obecného komentáře.

Tato flexibilita umožňuje lépe přizpůsobit knihovnu laboratořím s vlastními systémy dokumentace nebo specifickými požadavky řízení kvality.

Pokud jsou k dispozici odpovídající strukturní informace, NIST může automaticky doplnit také například InChIKey nebo odhadovaný retenční index.

Vysokorozlišovací a nízkorozlišovací knihovny je vhodné uchovávat odděleně

Uživatelské knihovny nemusí obsahovat pouze vysokorozlišovací spektra.

Cenná mohou být také nízkorozlišovací MS/MS spektra, například spektra získaná:

• fragmentací ve zdroji na jednoduchém kvadrupólu,
• pomocí MS/MS na trojitém kvadrupólu,
• v dalších workfow založených na nominální hmotnosti.

Doporučeným postupem je uchovávat vysokorozlišovací a nízkorozlišovací uživatelské knihovny odděleně, protože vhodné strategie vyhledávání a způsob práce s těmito daty se mohou lišit.

Také nízkorozlišovací spektra mohou poskytovat velmi kvalitní výsledky knihovního vyhledávání a mohou být užitečná například pro zachování historických dat nebo kombinování spekter z různých typů přístrojů.

Důležité softwarové aspekty při importu spekter

Při tvorbě knihoven je vhodné počítat také s několika praktickými vlastnostmi a omezeními softwaru.

Jedno z nich souvisí s nastavením Intensity Threshold v okně Spectrum Import Options. Pokud je při importu z výrobcova softwaru použita prahová hodnota intenzity, mohou být hodnoty vysokorozlišovacích spekter převedeny na nominální hmotnosti namísto zachování očekávané desetinné přesnosti.

Pro laboratoře vytvářející vysokorozlišovací knihovny jde o důležitý detail, protože právě přesná hmotnost patří mezi hlavní přednosti HRMS dat.

Další omezení se týká některých režimů knihovního vyhledávání po přidání vysokorozlišovacích spekter.

Omezení HiRes No Precursor a Hybrid Search

Po přidání vysokorozlišovacích spekter nemusí některé režimy HiRes NoPrecursor a Similarity Hybrid MS/MS fungovat správně.

Jedním z řešení je exportovat problematickou knihovnu pomocí nástroje Lib2NIST do ASCII souborů MSP spolu s odpovídajícími soubory molekulových struktur a poté data znovu importovat do formátu knihovny NIST.

Při těchto podmínkách se nedoporučuje spouštět problematický režim MS/MS Hybrid Search, protože může způsobit pád programu.

Vyhledávání EI Normal může částečně napodobit funkci HiRes No Precursor a může fungovat velmi dobře při současném prohledávání vysokorozlišovacích a nízkorozlišovacích knihoven.

HiRes NoPrecursor může fungovat také s vypnutým presearch, v takovém případě však může být doba vyhledávání výrazně delší.

Problémy se zobrazením v okně Chromatogram

Další vlastnost softwaru se týká způsobu zobrazování spektrálních hodnot na kartě Chromatogram.

Hodnoty nastavené v Spectrum Import Options se odrážejí v přímém porovnání spekter. Pokud jsou parametry nastaveny pro import nízkorozlišovacích spekter, mohou se zobrazené hodnoty m/z jevit jako zkrácené.

Důležité však je, že tento vizuální efekt neovlivňuje výsledky v tabulce dekonvoluce přesných hmotností a knihovního vyhledávání. Týká se pouze zobrazení porovnávaných spekter v horní části okna Chromatogram.

Je proto důležité odlišit chování zobrazovacího rozhraní od samotného zpracování dat, aby nebyly validní výsledky omylem považovány za poškozené.

Aktualizace knihovny po přidání nových záznamů

Správa uživatelské knihovny nekončí přidáním nového spektra.

Pokaždé, když je do knihovny vložen nový záznam obsahující molekulovou strukturu, je vhodné aktualizovat index struktur, aby bylo možné nový záznam správně zahrnout do vyhledávání podle struktury.

InChIKey se podle všeho aktualizuje společně se strukturou. Pokud však nastanou problémy s odstraňováním duplicitních záznamů, může být potřeba znovu vytvořit také index InChIKey.

Pokud uživatel přidá novou složku s knihovnou do adresáře NIST26/MSSEARCH ve chvíli, kdy je software NIST již spuštěný, je také třeba aktualizovat seznam knihoven, aby byla nová knihovna dostupná bez nutnosti restartovat celé prostředí.

Využití Lib2NIST k opravě vysokorozlišovacích uživatelských knihoven

Nástroj Lib2NIST hraje důležitou roli při řešení některých problémů spojených s vyhledáváním ve vysokorozlišovacích knihovnách.

Postup spočívá v exportu problematické vysokorozlišovací knihovny do souboru MSP spolu s jejími soubory molekulových struktur a následném opětovném importu dat do formátu knihovny NIST.

Opravenou knihovnu lze poté znovu umístit do adresáře NIST26 MSSEARCH. Před ověřením správné funkce nové verze je vhodné původní knihovnu zachovat pod jiným názvem.

Během konverzí pomocí Lib2NIST se také doporučuje software NIST Search zavřít.

I malá knihovna může mít vysokou analytickou hodnotu

Hlavní myšlenka je jednoduchá: uživatelská knihovna nemusí obsahovat stovky tisíc sloučenin, aby byla užitečná.

Pečlivě kurátorovaná kolekce spekter látek, které se opakovaně objevují ve vlastních vzorcích laboratoře, může významně zvýšit relevanci identifikací. To je zvláště důležité u sloučenin, které jsou proprietární, nově syntetizované, specifické pro konkrétní aplikaci nebo jsou jinak nedostatečně zastoupeny ve veřejných a komerčních databázích.

Kombinací MS/MS spekter s chemickými strukturami, akvizičními parametry, historií vzorků, tagy a interně definovanými informacemi může NIST26 fungovat nejen jako vyhledávač v komerčních databázích, ale také jako laboratorně specifická znalostní databáze postavená kolem sloučenin, které jsou pro danou práci skutečně důležité.

Pro specializované LC-MS/MS workflow tak může vytváření vlastních knihoven představovat jeden z nejefektivnějších způsobů, jak rozšířit možnosti spektrálního knihovního vyhledávání.