Problémy v NIST26 MS/MS a jejich praktická řešení

Vydání knihoven hmotnostních spekter NIST pro rok 2026 přináší rozšířené referenční knihovny tandemové hmotnostní spektrometrie (MS/MS) a software NIST MS Search ve verzi 4.0. Přestože tyto nástroje nabízejí pokročilé možnosti identifikace sloučenin a interpretace hmotnostních spekter, při praktickém testování bylo zjištěno několik problémů, kterým by uživatelé měli věnovat pozornost. Některé mohou ovlivnit identifikaci sloučenin, přesnost importovaných spekter nebo spolehlivost vyhledávání v knihovnách.

Zjištěné problémy se týkají extrahovaných iontových chromatogramů (XIC), nastavení prahové intenzity, zobrazování chromatogramů, uživatelských knihoven hmotnostních spekter a instalace softwaru. Další komplikace mohou nastat při propojení NIST MS Search s nástrojem MS Interpreter.

Popsaná pozorování pocházejí z testování provedeného v srpnu 2026. Jejich výskyt může záviset na konkrétních datech, konfiguraci softwaru nebo prostředí, ve kterém je nainstalován. Nelze proto předpokládat, že se všechny uvedené problémy projevují u každé instalace NIST26.

1. Filtrování pozadí může odstranit důležité identifikace z XIC

Jedním ze zjištěných problémů je nastavení Background při práci s extrahovanými iontovými chromatogramy (XIC). U některých datových souborů může použití filtrování pozadí odstranit píky, které obsahují potenciálně užitečné informace pro identifikaci sloučenin, a to i v případech, kdy vykazují vysokou relativní intenzitu a dobrou shodu s knihovními spektry.

Dotčené píky mají zpravidla několik společných vlastností:

• Jsou reprezentovány jediným skenem.
• Jejich chromatografická šířka je vyhodnocena jako nulová.
• Software jim přiřazuje hodnotu XIC = 0.
• Nesplňují kritéria pro zpracování pomocí nástroje XIC Analyzer.

Přesto mohou některé z těchto píků obsahovat analyticky významné informace. V jednom z testovaných případů dosahoval pík s hodnotou XIC = 0 relativní intenzity 100 % a současně vykazoval vysoké skóre shody s knihovním spektrem.

Problém spočívá v tom, že při aktivaci filtrování pozadí mohou být tyto píky vyloučeny nejen z výsledků identifikace, ale také z výpočtů relativních intenzit.

Aby nedocházelo k přehlédnutí potenciálně významných sloučenin, doporučuje se zkontrolovat výsledky bez aktivního filtrování pozadí nebo s nastavením Background na hodnotu „Any“. Píky s XIC = 0 lze seřadit podle intenzity a jednotlivě posoudit pomocí zrcadlového porovnání hmotnostních spekter (butterfly plot).

Případné významné identifikace je vhodné ověřit také v původních datech pomocí softwaru výrobce přístroje. Píky tvořené jediným skenem totiž mohou souviset rovněž s podmínkami měření nebo analytickými artefakty.

2. Nastavení Intensity Threshold může způsobit ztrátu přesných hodnot m/z

Další významný problém souvisí s funkcí Intensity Threshold v okně Spectrum Import Options.

Při testování bylo zjištěno, že aktivace prahové intenzity během importu MS/MS spekter ze softwaru výrobce přístroje může způsobit převod spekter s přesnými hodnotami m/z na spektra s nominálními hodnotami.

Namísto zachování hodnot m/z fragmentových iontů se čtyřmi desetinnými místy se v importovaných spektrech zobrazují pouze celočíselné hodnoty.

Tento problém je obzvláště závažný při analýzách MS/MS s vysokým rozlišením, kde přesné hodnoty m/z přispívají k určování sumárních vzorců fragmentových iontů a identifikaci sloučenin.

Funkce Intensity Threshold by přitom mohla být užitečná pro odstranění elektronického šumu, který byl pozorován například ve spektrech MS/MS získaných pomocí přístrojů Agilent.

Doporučené řešení: Při importu spekter, u kterých je nutné zachovat přesné hodnoty m/z, se doporučuje funkci Intensity Threshold nepoužívat. Do vyřešení problému je vhodné případné odstranění šumu provádět jinými, nezávisle ověřenými postupy zpracování dat.

3. Přesnost zobrazení v okně chromatogramu závisí na nastavení importu spekter

Související problém se projevuje také na kartě Chromatogram v softwaru NIST MS Search.

Počet desetinných míst zobrazovaných u hodnot m/z v okně chromatogramu je převzat z nastavení Spectrum Import Options. Tyto parametry nejsou řízeny nezávisle.

Pokud je například při importu nízkorozlišovacích spekter nastaveno zobrazování bez desetinných míst, projeví se stejné nastavení také v okně chromatogramu.

Důležité je, že tento problém neovlivňuje výsledky dekonvoluce s přesnými hodnotami m/z ani tabulku výsledků knihovního vyhledávání.

Může však ovlivnit spektra, která jsou z okna chromatogramu následně odesílána do knihovního vyhledávání.

Uživatelé by proto měli rozlišovat mezi hodnotami m/z zachovanými ve výsledcích dekonvoluce a hodnotami zobrazovanými nebo předávanými prostřednictvím rozhraní chromatogramu.

Před zahájením dalšího knihovního vyhledávání z okna chromatogramu je vhodné ověřit, že používaná přesnost hodnot m/z odpovídá požadavkům konkrétní analýzy.

4. Problémy s hybridním vyhledáváním a vyhledáváním bez prekurzorového iontu v uživatelských knihovnách

Další zjištěný problém se týká funkcí používaných při vyhledávání v uživatelských knihovnách MS/MS spekter.

Po přidání spekter s vysokým rozlišením do uživatelské knihovny nemusí správně fungovat následující režimy vyhledávání:

• HiRes NoPrecursor identity search
• Similarity Hybrid MS/MS search

Při testování mohl pokus o spuštění Hybrid MS/MS vyhledávání způsobit pád programu s chybovým kódem 0005.

Možným řešením je opětovné vytvoření uživatelské knihovny pomocí nástroje Lib2NIST:

1. Exportovat knihovní spektra do textových souborů .msp společně s odpovídajícími soubory molekulových struktur .mol.
2. Exportovaná data znovu importovat pomocí Lib2NIST.
3. Vytvořit novou knihovnu ve formátu NIST.
4. Ověřit správnou funkci požadovaných režimů vyhledávání.

Jako dočasnou alternativu lze využít režim EI Normal, který může poskytovat užitečné výsledky podobné vyhledávání HiRes NoPrecursor. Nelze jej však považovat za plnohodnotnou náhradu.

Režim HiRes NoPrecursor může fungovat také při vypnutí předběžného vyhledávání (presearch), v takovém případě se však může doba vyhledávání výrazně prodloužit.

Dokud nebude problém odstraněn, doporučuje se nepoužívat problematický režim Hybrid MS/MS u dotčených uživatelských knihoven.

5. Instalace a odinstalace mohou změnit konfigurační soubor Windows win.ini

Potenciální problémy s konfigurací byly pozorovány také při instalaci demonstrační verze NIST Tandem na počítačích, kde již byla nainstalována některá ze starších verzí softwaru NIST.

Instalační proces může konkrétně upravit konfigurační soubor Windows:

C:\Windows\win.ini

Při testování se současně nainstalovaným NIST23 a demonstrační verzí NIST Tandem byly do tohoto souboru přidány další konfigurační záznamy. Některé z nich zůstaly zachovány i po odinstalování demonstrační verze.

Tyto zbylé záznamy mohou potenciálně ovlivnit konfiguraci dříve nainstalovaných nebo následně instalovaných verzí softwaru NIST. Jejich skutečný dopad však nebyl ověřen u všech systémů.

Před instalací demonstrační verze se proto doporučuje:

• Vytvořit zálohu původního souboru win.ini.
• Zaznamenat stávající konfiguraci softwaru NIST.
• Po odinstalování zkontrolovat, zda v souboru nezůstaly záznamy související s demonstrační verzí.
• Při případném obnovení konfigurace zachovat správnou příponu souboru .ini.

Protože se soubor win.ini nachází v chráněném adresáři Windows, případné změny by měli provádět pouze oprávnění uživatelé, ideálně ve spolupráci se správcem IT.

6. MS Interpreter: Řešení problémů s registrací a propojením softwaru

Potíže se spuštěním NIST MS Interpreter mohou souviset spíše s registrací programu v prostředí Windows než se samotnou chybou softwaru NIST26.

MS Interpreter je samostatná aplikace spouštěná prostřednictvím souboru MSPCALC.EXE. Umožňuje interpretaci hmotnostních spekter na základě chemických struktur, sumárních vzorců fragmentových iontů a fragmentačních mechanismů.

Komunikace mezi NIST MS Search a MS Interpreter využívá registraci OLE/COM v systému Windows. Problémy mohou nastat například tehdy, když v systému zůstane registrována starší verze programu nebo pokud dojde k přesunutí, nahrazení či nesprávné instalaci jeho souborů.

NIST poskytuje nástroj MSINTREG.EXE, který umožňuje opětovné propojení MS Interpreter s NIST MS Search.

Doporučený postup zahrnuje:

1. Ukončení programu NIST MS Search.
2. Umístění souboru MSINTREG.EXE do složky obsahující MSPCALC.EXE, Frag32.dll a Qual.dll.
3. Spuštění registračního nástroje s potřebnými administrátorskými oprávněními.
4. Opětovné spuštění NIST MS Search a ověření propojení pomocí volby Send To → MS Interpreter.

V některých případech může pomoci také zrušení registrace předchozí verze příkazem UnregServer a následná registrace správné verze pomocí RegServer.

Uživatelé pracující na firemních nebo univerzitních počítačích mohou k provedení těchto operací potřebovat součinnost IT oddělení.

Praktická doporučení pro uživatele NIST26

Popsané problémy ukazují, jak důležité je při zpracování dat tandemové hmotnostní spektrometrie kontrolovat nastavení softwaru a ověřovat získané výsledky.

Zvláštní pozornost je vhodné věnovat zachování přesných hodnot m/z při importu spekter, kontrole signálů vyloučených filtrováním XIC a ověření funkčnosti uživatelských knihoven.

Pravidelné zálohování knihoven a konfiguračních souborů může zároveň pomoci předcházet komplikacím při instalaci nebo aktualizaci softwaru NIST.

Přestože NIST26 nabízí rozsáhlé možnosti interpretace MS/MS dat, znalost potenciálních omezení a využívání vhodných náhradních postupů může laboratořím pomoci dosahovat spolehlivějších výsledků identifikace a zachovat efektivní analytické pracovní postupy.

Dostupnost případných oprav a jejich začlenění do novějších verzí softwaru je vždy vhodné ověřit pro konkrétní vydání a používanou verzi programu.