Odesílání tandemových MS/MS spekter do NIST26

NIST26 obsahuje integrované nástroje pro zpracování LC-MS/MS dat, existují však situace, kdy může být práce přímo v softwaru výrobce přístroje rychlejší a praktičtější. Pokud je třeba vyhodnotit pouze několik píků, převod do formátu mzML není výhodný nebo pracujete s daty nominálních hmotností, lze spektra přenést přímo do NIST Library Search a následně je identifikovat. Tento postup může zjednodušit spektrální vyhledávání a současně zachovat přístup k vysokorozlišovacím i nízkorozlišovacím knihovnám NIST, veřejným MS/MS databázím a flexibilnímu nastavení vyhledávání.

Kdy má přímý přenos ze softwaru výrobce smysl?

NIST26 nabízí integrované zpracování dat na kartě Chromatogram, včetně workflow pro dekonvoluci a knihovní vyhledávání. V mnoha případech jde o nejkomplexnější způsob zpracování LC-MS/MS dat.

Zpracování chromatogramu však obvykle vyžaduje převod původních dat výrobce do formátu mzML, například pomocí ProteoWizard/MSConvert. Pokud je chromatogram relativně jednoduchý, není potřeba dekonvoluce a je třeba analyzovat pouze několik píků, může převod a zpracování celého souboru představovat zbytečný krok.

V takových situacích může být efektivnější vybrat MS/MS spektrum přímo v původním softwaru výrobce a odeslat jej do NIST Library Search.

Existují také další případy, kdy je přímý přenos obzvlášť užitečný. Některé proprietární datové formáty nemusí být při převodu do mzML plně kompatibilní, zatímco MS/MS data s nominálními hmotnostmi nejsou na kartě Chromatogram v NIST26 podporována pro MS/MS vyhledávání. Pro tento typ dat je proto praktickou alternativou přenos nebo import spekter přímo do Library Search.

Který software výrobců umožňuje posílat spektra přímo do NIST?

Přímou integraci s NIST Library Search nabízí několik hlavních platforem výrobců analytické instrumentace.

Workflow je dostupné například v softwaru:

• Agilent, včetně MassHunter a OpenLab,
• Waters,
• Thermo Fisher Scientific.

Také Wiley KnowItAll umožňuje import spekter do NIST Search a prostřednictvím svého softwarového prostředí podporuje řadu datových formátů různých výrobců.

U některých dalších platforem nemusí být přímá integrace s NIST dostupná. V takovém případě lze spektra potenciálně exportovat do textových formátů, například TXT nebo MSP ASCII, a následně je importovat do Spectrum List v NIST Library Search.

Přímý přenos je zpravidla pohodlnější, protože odpadá mezikrok exportu a následného importu dat.

Praktický příklad se softwarem Agilent

Workflow lze demonstrovat na softwaru Agilent. Analytik nejprve vybere požadovanou oblast MS/MS dat, v případě potřeby spektrum zprůměruje a přenese jej do zobrazení spektra. Odtud lze spektrum odeslat do NIST pomocí příkazu Search Using NIST MS Program.

Po správném nastavení NIST spektrum automaticky přijme a spustí definované vyhledávání. Před rutinním používáním tohoto workflow je však důležité pečlivě zkontrolovat parametry importu a knihovního vyhledávání.

Nastavení importu spekter s přesnou hmotností

U vysokorozlišovacích MS/MS dat je prvním důležitým krokem nastavení v části Spectrum Import Options. Spektra s přesnou hmotností by měla být importována se správným počtem desetinných míst pro prekurzorové a produktové ionty a jako typ spektra je nutné zvolit Accurate m/z.

Zachování přesnosti hmotnosti je zásadní, protože jednou z hlavních výhod knihovního vyhledávání HRMS dat je možnost rozlišovat kandidátní sloučeniny na základě přesných hmotností prekurzorových a fragmentových iontů.

Po správném nastavení importu lze pokračovat konfigurací parametrů knihovního vyhledávání.

Vyhledávání bez prekurzorového iontu

V závislosti na tom, jak je spektrum ve výrobcově softwaru vybráno nebo zprůměrováno, nemusí být informace o prekurzoru vždy automaticky přenesena.

NIST26 však dokáže takové spektrum vyhledávat v režimu HiRes NoPrecursor.

Pokud je m/z prekurzoru známé, lze jej alternativně zadat ručně a zahrnout jej do vyhledávání.

Vyhledávání bez prekurzoru je praktické zejména při rychlém screeningu ručně vybraných MS/MS spekter, kdy již samotný fragmentační profil obsahuje dostatek informací pro nalezení relevantních kandidátů.

Nastavení hmotnostních tolerancí

Pro MS/MS vyhledávání založené na přesné hmotnosti je zásadní správně nastavit tolerance prekurzorových a produktových iontů.

Příklad nastavení používá:

• 20 ppm pro prekurzorový ion
• 40 ppm pro produktové ionty

Tyto hodnoty mohou odpovídat nastavení používanému také ve workflow NIST26 Chromatogram.

Správné nastavení tolerancí pomáhá vyvážit citlivost a selektivitu vyhledávání. Příliš široké tolerance mohou vést k většímu počtu nerelevantních kandidátů, zatímco příliš úzké tolerance mohou kvůli běžné variabilitě měření vyřadit i správné shody.

Kombinace více spektrálních knihoven

Jednou z předností NIST Search je možnost současně prohledávat více knihoven.

Typické nastavení může zahrnovat vysokorozlišovací MS/MS knihovnu NIST společně s nízkorozlišovací tandemovou knihovnou NIST.

Nízkorozlišovací knihovna NIST může být využita také v rámci workflow s přesnými hmotnostmi, protože obsahuje potřebné indexy. Ne každá vlastní nebo starší nízkorozlišovací knihovna však bude s tímto typem vyhledávání kompatibilní.

Do vyhledávání lze zahrnout také další veřejné zdroje, například:

• MS-DIAL knihovny pro pozitivní ionizační mód,
• MS-DIAL knihovny pro negativní ionizační mód,
• MoNA LC-MS/MS.

Kombinace komerčních a veřejných knihoven může výrazně rozšířit spektrální pokrytí. V demonstrovaném workflow bylo možné v jediné konfiguraci prohledávat několik milionů spekter.

Pro laboratoře zabývající se neobvyklými metabolity, nečistotami, environmentálními kontaminanty nebo sloučeninami, které nejsou dostatečně zastoupeny v běžných komerčních knihovnách, může být takto rozšířený vyhledávací prostor velmi cenný.

Vyhledávání struktur vyžaduje samostatný výběr knihoven

MS/MS vyhledávání a vyhledávání podle struktury nemusí používat stejné knihovny.

Pokud je požadováno strukturní vyhledávání, je nutné v odpovídajícím nastavení Library Search načíst také příslušné knihovny obsahující chemické struktury.

Při prvním nastavování NIST26 lze tento rozdíl snadno přehlédnout. Knihovna může obsahovat užitečná spektra, ale nemusí obsahovat přiřazené struktury, případně je nutné strukturní databázi explicitně vybrat před spuštěním vyhledávání podle substruktury nebo podobnosti struktur.

Automatizace vyhledávání

Po nastavení knihoven a tolerancí lze aktivovat funkci Automatic Search.

Spektrum přenesené ze softwaru výrobce pak automaticky spustí vyhledávání, aniž by jej uživatel musel pokaždé manuálně zahajovat.

U opakovaných workflow s větším množstvím ručně vybraných píků může i tato jednoduchá automatizace ušetřit značné množství času.

Po optimalizaci celé konfigurace je vhodné ji uložit jako samostatné nastavení – například jako konfiguraci určenou specificky pro spektra importovaná ze softwaru výrobce.

Jak pracovat s tabulkou výsledků

Výsledky vyhledávání NIST jsou obvykle řazeny podle parametru score, pro interpretaci shod však lze využít také další ukazatele.

Mezi dostupná pole mohou patřit:

• score,
• reverse score,
• partial spectrum search score,
• dot product,
• molekulová hmotnost,
• další uživatelsky zvolené parametry.

Zobrazení výsledků lze přizpůsobit kliknutím pravým tlačítkem na záhlaví sloupců a přidáním či odebráním jednotlivých polí.

Standardní score obvykle zůstává hlavním kritériem řazení, alternativní metriky však mohou být užitečné při hodnocení spekter s chybějícími fragmenty, přidanými píky, částečným spektrálním překryvem nebo u strukturně příbuzných sloučenin.

Proč může být užitečné ponechat zobrazené duplicitní shody

NIST obsahuje funkci Best Matching Only, která omezuje zobrazení duplicitních nebo opakovaných záznamů. Po jejím zapnutí může software například několik knihovních záznamů stejné sloučeniny redukovat pouze na nejlepší reprezentativní shodu.

Výsledkový seznam se tím zpřehlední, ale zároveň mohou být skryty užitečné informace. Při prvotním vyhodnocení je proto často vhodnější ponechat tuto možnost vypnutou a zobrazit všechny odpovídající spektrální shody. Více spekter stejné sloučeniny může pocházet z různých kolizních energií, přístrojů, iontových forem nebo různých knihoven a jejich vzájemné porovnání může identifikaci dále podpořit.

Filtry lze kdykoli použít později, jakmile analytik získá přehled o celém souboru výsledků.

Vizuální porovnání neznámého a knihovního spektra

NIST Library Search nabízí několik vzájemně se doplňujících pohledů na jednotlivé kandidáty. Experimentálně získané spektrum neznámé látky je zobrazeno společně s vybraným knihovním spektrem a head-to-head porovnání spekter umožňuje okamžitě vizuálně posoudit shodné i neshodné ionty.

To je důležité, protože výsledné skóre knihovního vyhledávání by nemělo být považováno za plně automatické rozhodnutí o identifikaci. I velmi dobrou shodu je vhodné vizuálně zkontrolovat, zejména u komplexních spekter, fragmentů s nízkou intenzitou, společně izolovaných iontů nebo sloučenin s velmi podobnými strukturními analogy.

Kombinace numerického skórování a vizuální kontroly poskytuje spolehlivější základ pro interpretaci výsledků.

Důležitý problém s nastavením Intensity Threshold

Při importu vysokorozlišovacích spekter je třeba věnovat pozornost jednomu praktickému softwarovému problému.

Okno Spectrum Import Options obsahuje funkci Intensity Threshold, která může odstranit signály s nízkou intenzitou a omezit spektrální šum.

Teoreticky jde o užitečnou možnost. Pokud je však prahová hodnota intenzity při importu použita, mohou importovaná vysokorozlišovací spektra ztratit desetinnou informaci o hmotnosti a být přenesena jako spektra s nominální hmotností.

Pík s přesnou hodnotou například 176,0815 se tak může zobrazit pouze jako m/z 176.

Pro uživatele HRMS to znamená ztrátu jedné z nejdůležitějších informací v datech a může to negativně ovlivnit vyhledávání založené na přesné hmotnosti.

Dokud nebude toto chování opraveno, je bezpečnější při importu vysokorozlišovacích spekter funkci Intensity Threshold nepoužívat a případnou filtraci provádět jiným způsobem.

Související problém se zobrazením v okně Chromatogram

Druhé softwarové chování souvisí s tím, jak se nastavení Spectrum Import Options promítá do karty Chromatogram. Pokud je pro import nízkorozlišovacích spekter nastavena desetinná přesnost na nulu, může se v head-to-head porovnání následně zobrazovat m/z se zkrácenými hodnotami.

Důležité je, že jde pouze o problém zobrazení.

Neovlivňuje výsledky dekonvoluce s přesnou hmotností ani tabulku knihovního vyhledávání. Zpracovaná data zůstávají nezměněna; upravené nastavení se projeví pouze při vizuálním porovnání spekter v horní části okna Chromatogram. Rozlišení mezi chováním zobrazení a skutečným zpracováním dat pomáhá zabránit mylnému dojmu, že došlo ke ztrátě informace o přesné hmotnosti.

Kdy je přímé vyhledávání ze softwaru výrobce nejvýhodnější?

Přímý přenos ze softwaru výrobce nemá nahrazovat kompletní workflow NIST26 Chromatogram. Jde o doplňkovou cestu pro situace, kdy není úplné chromatografické zpracování nutné nebo dostupné.

Zvláště vhodná je například tehdy, když:

• je potřeba identifikovat pouze několik píků,
• není nutná dekonvoluce,
• převod do mzML představuje zbytečný mezikrok,
• soubory výrobce nelze spolehlivě převést,
• je třeba vyhledávat MS/MS spektra s nominální hmotností,
• spektra již byla zkontrolována a vybrána v prostředí výrobce.

V těchto případech poskytuje přímý přenos spektra rychlou cestu od původních MS/MS dat ke spektrální knihovní identifikaci.

Propojení softwaru výrobce s širšími možnostmi NIST26

Toto workflow zároveň ukazuje jednu z širších výhod NIST26: analytik nemusí volit mezi softwarem výrobce přístroje a nezávislým prostředím pro spektrální vyhledávání.

Software výrobce může zůstat primární platformou pro prohlížení chromatogramů a výběr spekter, zatímco NIST poskytuje přístup k rozsáhlým komerčním knihovnám, veřejným MS/MS databázím, flexibilnímu skórování, spektrálnímu porovnání a dalším interpretačním nástrojům.

Společné využití obou prostředí tak může vytvořit praktické workflow jak pro rychlé rutinní vyhledávání, tak pro detailnější identifikaci neznámých sloučenin.

Klíčem je správná konfigurace. Nastavení importu přesných hmotností, hmotnostních tolerancí, výběru knihoven, režimu vyhledávání i způsobu zobrazení výsledků významně ovlivňuje účinnost celého workflow.

Jakmile jsou tyto parametry správně nastaveny a konfigurace uložena, může se odesílání spekter ze softwaru výrobce do NIST26 stát rychlou a opakovatelnou součástí každodenní interpretace LC-MS/MS dat.