Jak rozšířit MS/MS vyhledávání v NIST26 pomocí volně dostupných spektrálních knihoven

Knihovny NIST MS/MS představují základní zdroj pro spolehlivou identifikaci sloučenin pomocí tandemové hmotnostní spektrometrie. Jejich pokrytí však lze dále rozšířit využitím veřejně dostupných spektrálních databází. James Little z Mass Spec Interpretation Services ve své prezentaci ukazuje, jak lze knihovny MoNA a MS-DIAL převést do formátu kompatibilního s NIST a začlenit je do funkcí Chromatogram Search a Library Search v NIST26. Výsledkem je praktický přístup, který kombinuje kvalitu kurátorovaných dat NIST s širším pokrytím veřejných zdrojů. 

NIST jako základ celé strategie

Podle prezentace by komerční tandemové knihovny NIST měly zůstat primárním zdrojem pro vysoce spolehlivou MS/MS identifikaci. Jejich hlavní výhodou jsou kurátorovaná a standardizovaná referenční spektra, široké pokrytí a vysoká kvalita identifikací. Volně dostupné a uživatelské knihovny nemají NIST nahrazovat, ale doplňovat o sloučeniny, které v základní kolekci nemusí být zastoupeny.

Vzniká tak strategie postavená kolem NIST MS/MS Library, kterou lze rozšířit o veřejné zdroje, jako jsou MoNA (MassBank of North America), MS-DIAL nebo vlastní uživatelské MSP knihovny.

Takové rozšíření může zvýšit šanci na nalezení dalších kandidátních sloučenin, rozšířit chemický prostor vyhledávání a poskytnout doplňující informace o strukturách nebo anotacích.

Současně je ale nutné rozlišovat mezi úrovní jistoty jednotlivých výsledků. Shody pocházející pouze z veřejných knihoven by měly být považovány za předběžné, pokud nejsou potvrzeny dalšími důkazy, například retenčním časem, autentickým standardem, diagnostickými fragmenty nebo jinými ortogonálními daty.

Více než 500 000 volně dostupných MS/MS spekter

Prezentovaný workflow využívá volně dostupná tandemová hmotnostní spektra z databází MoNA a MS-DIAL.

Použitá knihovna MoNA obsahuje přibližně 150 000 LC-MS/MS spekter. MS-DIAL přidává zhruba 300 000 spekter v pozitivním ionizačním módu a dalších 40 000 spekter v negativním módu.

Celkem tak tyto veřejné zdroje poskytují přibližně 500 000 MS/MS spekter, která reprezentují asi 30 000 unikátních sloučenin.

Pro srovnání obsahují tandemové knihovny NIST 2026 přibližně 3 miliony MS/MS spekter zahrnujících vysokorozlišovací, nízkorozlišovací a APCI data a přibližně 70 000 unikátních sloučenin. Autor proto doporučuje používat NIST26 jako hlavní knihovnu a veřejné databáze využívat především pro rozšíření pokrytí.

Výhodou není pouze vyšší počet dostupných spekter. Jednotlivé veřejné databáze mohou obsahovat sloučeniny, spektra z různých ionizačních módů nebo varianty fragmentace, které v hlavní knihovně NIST nejsou zastoupeny.

Integrace veřejných knihoven do NIST Search

Volně dostupné knihovny lze převést do formátu NIST MSP a uložit vedle standardních knihoven NIST.

Prezentace ukazuje, že po stažení lze veřejné knihovny umístit do adresáře MSSEARCH, kde se následně objeví mezi knihovnami dostupnými pro vyhledávání.

Uživatel tak může jejich spektra využívat přímo ve funkcích Chromatogram Search i Library Search.

James Little doporučuje nejprve pracovat s již připravenými kopiemi veřejných knihoven ve formátu NIST. Pokud se ukážou jako užitečné, je vhodné naučit se vytvářet vlastní aktualizované verze z novějších dat dostupných na internetu.

Zároveň jednoznačně doporučuje vytvořit také vlastní uživatelskou knihovnu obsahující spektra relevantní pro konkrétní laboratoř nebo aplikaci.

Taková knihovna může být zvláště cenná pro rutinně sledované sloučeniny, interně charakterizované standardy nebo specializované aplikace, u nichž mají veřejné či komerční zdroje omezené pokrytí.

Nastavení tolerancí při vyhledávání

Při kombinování dat z různých zdrojů je důležité správné nastavení parametrů vyhledávání.

Pro vysokorozlišovací MS/MS data prezentace doporučuje využít nastavení NIST určené pro high-resolution spektra. Jako příklad je uvedena tolerance produktových iontů přibližně ±40 ppm.

U některých vyhledávacích režimů není nastavení prekurzorového iontu rozhodující, protože vyhledávání v zásadě porovnává experimentální fragmentační spektrum s referenčním MS/MS spektrem.

Veřejné knihovny však mohou obsahovat také část nízkorozlišovacích dat. Na tuto skutečnost je třeba při interpretaci výsledků myslet, zejména pokud jedna databáze kombinuje spektra různých kvalitativních úrovní.

Užitečným nástrojem mohou být také similarity searches. Pokud v knihovně není přesná sloučenina, několik nejlepších shod může napovědět alespoň strukturní třídu analytu a nasměrovat další identifikaci.

Proč u některých výsledků chybí struktury

Jedním z omezení veřejných knihoven je neúplnost metadat.

Prezentace tento problém demonstruje na příkladu imazapyru. Chromatogram Search může nalézt kvalitní spektrální shodu s knihovním záznamem, který neobsahuje chemickou strukturu, přestože v databázi existují další záznamy stejné látky, které strukturu již obsahují.

Uživatel by se proto neměl vždy omezit pouze na jediný nejlépe hodnocený výsledek.

V prezentovaném příkladu měla řada dalších shod strukturu k dispozici, zatímco nejlepší výsledek nalezený v Chromatogram Search ji postrádal. Autor proto doporučuje zkontrolovat, že není aktivována možnost „Best Matching Only“, která by mohla alternativní nebo duplicitní záznamy se strukturou skrýt.

Tento příklad dobře ukazuje jednu z vlastností komunitních databází: samotné spektrum může být velmi hodnotné, i když metadata nejsou vždy kompletní nebo standardizovaná.

Vlastní aktualizované knihovny

Veřejné spektrální databáze se průběžně rozšiřují, takže jednou stažená knihovna postupně zastarává.

Závěrečná část prezentace proto doporučuje naučit se vytvářet vlastní aktualizované knihovny kompatibilní s NIST přímo z internetových zdrojů.

Mezi uvedené zdroje patří například MassBank Europe, MoNA a MS-DIAL, které poskytují spektrální data vhodná pro převod do knihoven NIST.

Laboratoř si tak může vytvořit knihovní prostředí odpovídající jejím konkrétním analytickým potřebám a průběžně jej aktualizovat.

Hlavním závěrem prezentace proto není volba mezi NIST a veřejnými knihovnami, ale jejich vhodná kombinace: NIST26 jako kvalitativní základ pro spolehlivou identifikaci, MoNA, MS-DIAL a další veřejné knihovny pro rozšíření pokrytí a vlastní uživatelské knihovny pro specifické potřeby laboratoře.