Vyhledávání spekter a knihoven s nízkým rozlišením v NIST26

Přístroje umožňující měření přesné hmotnosti představují výkonné nástroje pro identifikaci sloučenin, nejsou však jedinou možností, jak využívat moderní knihovny tandemových hmotnostních spekter. NIST26 nabízí také vyhledávací funkce pro MS/MS data s nominálními hmotnostmi, a umožňuje tak identifikaci s využitím spektrálních knihoven i laboratořím vybaveným LC-MS systémy s jednoduchým nebo trojitým kvadrupólem. Klíčový je správný výběr knihoven, vyhledávacích algoritmů a nastavení importu spekter.

Proč je vyhledávání MS/MS spekter s nízkým rozlišením důležité?

Mnoho laboratoří získává fragmentační spektra pomocí hmotnostních spektrometrů s trojitým kvadrupólem vybavených kolizní celou nebo pomocí systémů s jednoduchým kvadrupólem, které umožňují kolizně indukovanou disociaci (CID) přímo v iontovém zdroji. Přestože tato spektra neobsahují informace o přesných hmotnostech poskytované hmotnostní spektrometrií s vysokým rozlišením (HRMS), mohou jejich charakteristické fragmentační vzory představovat cenný podklad pro identifikaci sloučenin.

Pokud je hledaná sloučenina zastoupena v referenční knihovně a podmínky fragmentace jsou dostatečně srovnatelné, mohou i spektra s nominálními hmotnostmi poskytovat významné shody. Laboratoře tak mohou identifikovat neznámé látky pomocí přístrojového vybavení, které již běžně používají.

Přesná hmotnost nadále představuje důležitý doplňující zdroj selektivity a jistoty identifikace, zejména při rozlišování sloučenin s podobnými fragmentačními vzory.

V jakých spektrálních knihovnách lze vyhledávat?

NIST26 umožňuje vyhledávání v několika typech referenčních knihoven:

• Knihovny NIST MS/MS s vysokým rozlišením: hr_msms_nist a apci_msms, které obsahují spektrální informace o přesných hmotnostech.
• Knihovna NIST MS/MS s nízkým rozlišením: lr_msms_nist, která obsahuje speciální indexování umožňující vyhledávání jejích záznamů v určitých režimech MS/MS vyhledávání podle přesné hmotnosti i při vyhledávání podle nominálních hmotností.
• Veřejně dostupné knihovny: MoNA (mona_lcmsms) a knihovny MS-DIAL, které obsahují převážně spektra s přesnými hmotnostmi, ale zahrnují také některá spektra s nominálními hmotnostmi.
• Uživatelské knihovny: Vlastní soubory MS/MS spekter s nízkým rozlišením, které laboratoř získala a zpracovala.

Pro širší vyhledávání lze vybrat kombinaci vhodných knihoven. O tom, které záznamy budou skutečně zahrnuty do vyhledávání, však rozhoduje zvolený režim, i když je současně aktivováno několik knihoven.

Volba vhodného režimu vyhledávání v NIST26

Jednou z užitečných vlastností NIST26 je možnost vyhledávat MS/MS spektra s nízkým rozlišením pomocí algoritmů, jejichž názvy odkazují na elektronovou ionizaci (EI). Navzdory tomuto označení lze tyto funkce využít také k porovnávání fragmentačních vzorů s nominálními hmotnostmi získaných metodou LC-MS/MS.

Identity → EI Normal

Tento režim představuje vhodný výchozí bod pro identifikaci na základě MS/MS spekter s nízkým rozlišením.

Algoritmus přisuzuje relativně vyšší váhu fragmentovým iontům s vyššími hodnotami m/z, které mohou být zvláště užitečné pro rozlišení struktur jednotlivých sloučenin.

Similarity → Simple EI

Tento režim poskytuje vyváženější porovnání pozorovaných píků bez stejného zvýhodnění iontů s vyššími hodnotami m/z.

Může být užitečný při hodnocení celkové podobnosti experimentálních a referenčních fragmentačních vzorů.

Similarity → MS/MS EI

Tato funkce slouží k jinému účelu: porovnává MS/MS spektrum hledané látky s referenčními spektry získanými elektronovou ionizací. Nejde tedy pouze o další způsob vyhledávání v knihovně MS/MS spekter.

Jak se tyto režimy liší od vyhledávání Identity MS/MS?

Režimy Identity → MS/MS a HiRes NoPrecursor pracují primárně se spektrálními údaji o přesných hmotnostech.

Běžné uživatelské knihovny spekter s nízkým rozlišením zpravidla nezahrnují. Důležitou výjimkou je speciálně indexovaná knihovna NIST lr_msms_nist.

Neúspěšné vyhledávání v režimu MS/MS proto nemusí nutně znamenat, že referenční spektrum s nízkým rozlišením není k dispozici.

Opakování vyhledávání v režimu EI Normal nebo Simple EI může odhalit další kandidátní sloučeniny.

Uživatelé, kteří často přepínají mezi různými typy vyhledávání, mohou nastavit typ spektra na Any. V rozhraní tak zůstanou dostupné příslušné funkce EI i MS/MS.

Import experimentálních spekter a jejich vyhledávání

Vyhledávání začíná přenosem experimentálního spektra produktových iontů do seznamu Spec List v programu NIST.

V ukázkovém pracovním postupu se spektra získaná v softwaru Agilent MassHunter přenášejí pomocí funkce Send NIST Lib. V závislosti na použitém datovém systému lze využít také odpovídající propojení nebo export do podporovaného textového formátu či formátu MSP.

Správné nastavení importu je zásadní:

1. U dat s nominálními hmotnostmi vyberte v nastavení importu spekter možnost EI (normal m/z).
2. U dat s přesnými hmotnostmi vyberte Accurate m/z a zachovejte odpovídající počet desetinných míst.
3. Před spuštěním vyhledávání zvolte příslušné knihovny a režim vyhledávání.
4. Seznam nalezených shod posuzujte společně s experimentálními a referenčními spektry. Nespoléhejte se pouze na nejvýše hodnocený výsledek.

Často používaná nastavení lze uložit pomocí File → Save Configuration, což přispívá k reprodukovatelnosti pracovního postupu při rutinních analýzách.

Interpretace skóre shody a alternativního řazení výsledků

Seznam nalezených výsledků nabízí několik způsobů hodnocení shody spekter. Jednotlivé ukazatele reagují odlišně na šum, neúplnou fragmentaci a přítomnost dalších iontů v experimentálním spektru.

LabRulez / Mass Spec Interpretation Services/James Little: Interpretace skóre shody a alternativního řazení výsledků

V nastavení vlastností seznamu výsledků lze přidat další sloupce, například MW, R. Match a PSS Match.

Molekulová hmotnost je zvláště užitečná při ověřování, zda navržená neutrální molekula odpovídá zvolenému prekurzorovému iontu, včetně běžných aduktů, jako je [M+H]⁺.

Proč změna řazení výsledků není totéž jako nové vyhledávání?

Je důležité rozlišovat mezi seřazením již získaného seznamu podle jiného ukazatele a spuštěním nového vyhledávání optimalizovaného pro daný ukazatel.

Předběžný výběr kandidátů při úvodním vyhledávání podle celého spektra mohl některé sloučeniny již vyloučit.

U obtížných vzorků proto může samostatné vyhledávání pomocí reverzní shody nebo částečného spektra poskytnout více informací než pouhá změna pořadí původních výsledků.

Tento rozdíl je zvláště důležitý tehdy, pokud experimentální spektra obsahují výrazný šum, interferující ionty nebo pouze omezený počet informativních fragmentů.

Praktický příklad: Identifikace trazodonu

Příkladem vyhledávání MS/MS spektra s nominálními hmotnostmi je analýza trazodonu s protonovaným prekurzorovým iontem přibližně při m/z 372.

Vyhledávání identity pomocí algoritmu typu EI poskytuje referenční spektra, která lze posoudit podle pořadí výsledků i přímým porovnáním fragmentových píků.

Nominální molekulová hmotnost neutrální sloučeniny, přibližně 371, představuje další kontrolu věrohodnosti identifikace ve vztahu k prekurzorovému iontu.

Práce s duplicitními záznamy v knihovnách

Nastavení Best Matching Only umožňuje výsledky dále zpřehlednit.

Pomocí identifikátorů InChIKey dokáže seskupovat opakované záznamy stejné chemické struktury a zkrátit tak dlouhý seznam spekter na menší počet odlišných kandidátních sloučenin.

Po vypnutí této možnosti však může analytik samostatně prohlížet více referenčních spekter, což je užitečné zejména v případě rozdílných kolizních energií a relativních intenzit iontů.

Stejně jako u každého vyhledávání v knihovně by se věrohodnost nalezené shody měla posuzovat podle:

• Výběru prekurzorového iontu a molekulové hmotnosti
• Shody fragmentových iontů v experimentálním a referenčním spektru
• Relativních intenzit fragmentových iontů
• Složení vzorku a analytického kontextu
• Dalších dostupných analytických důkazů

Vysoké skóre shody s knihovním spektrem je cenným podkladem, samo o sobě by však nemělo být považováno za definitivní potvrzení struktury.

Na co si dát pozor při importu a zobrazení spekter?

Dva projevy chování softwaru zaznamenané při demonstraci NIST26 ukazují, proč je důležité ověřit importovaná data ještě před interpretací výsledků vyhledávání.

Prahová hodnota intenzity a přesnost hmotností

Při použití nastavení Intensity Threshold v možnostech importu spekter byla data přenesená ze softwaru výrobce importována pouze s nominálními hodnotami m/z, přestože bylo nastaveno zachování přesných hmotností.

Uživatelé pracující s HRMS daty by proto měli ověřit, zda si importované hodnoty m/z zachovaly očekávaný počet desetinných míst, a otestovat nastavení filtrování podle intenzity ve vlastní instalaci programu.

Zkrácené hodnoty hmotností v okně Chromatogram

Po použití nastavení importu pro spektra s nízkým rozlišením se některé ionty v okně Chromatogram zobrazovaly se zkráceným počtem desetinných míst, přestože pocházely z měření přesných hmotností.

V uvedeném případě šlo o problém zobrazení v horní části okna s porovnáním spekter, nikoli o ovlivnění výsledků dekonvoluce nebo vyhledávání v knihovnách podle přesných hmotností.

Tyto poznatky je vhodné chápat jako upozornění na možné chování konkrétní verze programu a pracovního postupu, nikoli jako vlastnost všech instalací NIST26.

Závěr

MS/MS spektra s nízkým rozlišením mohou být účinným podkladem pro vyhledávání v referenčních knihovnách, pokud je hledaná sloučenina v knihovně zastoupena a vyhledávání je správně nastaveno.

NIST26 nabízí několik vzájemně se doplňujících strategií. Režimy Identity EI Normal a Similarity Simple EI jsou zvláště užitečné pro vyhledávání v knihovnách MS/MS spekter s nominálními hmotnostmi.

Správné nastavení importu, kontrola referenčních spekter a informované využití skórovacích ukazatelů Dot, Rev-Dot a PSS-Dot mohou zlepšit posouzení kandidátních sloučenin, aniž by bylo pro každý prvotní krok identifikace nezbytné používat přístroj umožňující měření přesných hmotností.