Development of pH Gradient Mobile Phase Concentrates for Robust, High Resolution mAb Charge Variant Analysis

Význam tématu

Proteinové terapeutika, zejména monoklonální protilátky (mAbs), jsou klíčové pro léčbu řady onemocnění. Jejich post-translační modifikace, které ovlivňují distribuci nabitých variant, vyžadují pečlivou charakterizaci, protože i drobné strukturní změny mohou ovlivnit stabilitu, účinnost a bezpečnost léčiv. Ionexová chromatografie s pH gradientem představuje univerzální platformu pro robustní a vysoce rozlišené sledování těchto nabitých variant napříč širokým rozsahem izoelektrických bodů.

Cíle a přehled studie

• Navrhnout a optimalizovat binární pH gradientní mobilní fázi vhodnou pro mAbs s pI 6–10.
• Zajistit konzistentní a lineární pH gradient s konstantní kapacitou pufru.
• Porovnat výkonnost nových BioResolve CX pH koncentrátů s konkurenčními systémy.

Použitá metodika a instrumentace

Ionexová chromatografie s pH gradientem na BioResolve SCX mAb sloupcích (3 µm, 4,6 × 50 mm). Binární mobilní fáze připravená z BioResolve CX pH koncentrátů A (pH 5,0) a B (pH 10,2) obsahuje biologicky kompatibilní pufry: sukcinovou kyselinu, BIS-TRIS propane, triethanolamin a CAPSO. Linearita pH byla ověřena pomocí měření MAPE při různých gradientních strmostech. Pro sledování pH během eluce byl použit GE Healthcare Monitor pH/C-900.

Použitá instrumentace

• ACQUITY UPLC H-Class Bio System se titanovou detekční cely.
• BioResolve SCX mAb kolony (3 µm, 4,6 × 50 mm).
• Empower 3 Software pro řízení a zpracování dat.
• GE Healthcare Monitor pH/C-900 pro měření pH a vodivosti.

Hlavní výsledky a diskuse

• Optimalizovaný poměr pufrů zajistil vyváženou retenci a rozlišení mAbs s pI 6,7–9,4.
• Lineární pH gradient (ΔpH/ΔCV < 0,5) dosahoval MAPE < 2,1 % a vysoké reprodukovatelnosti.
• BioResolve systém překonal konkurenční technologii v parametrech rozlišení (Pc*, Rs*, p/v) a nižším carry-over.
• Umožněna rychlá analýza (20 min) oproti tradičním 50min metodám, přičemž byla zachována nebo zlepšena rozlišovací schopnost.
• Stabilita metody potvrzena životnostním testem nad 500 injekcemi bez významné změny retence či tlaku.

Přínosy a praktické využití metody

• Platformní přístup umožňuje snadné zavedení do QC procesů bez potřeby rozsáhlé optimalizace pro každý mAb.
• Univerzální pH gradient pokrývá široký rozsah izoelektrických bodů (6–10) v jedné metodě.
• Zefektivnění analýzy vedoucí k úspoře času a zdrojů při zachování vysoké kvality dat.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s hromadnou spektrometrií pro detailní identifikaci variant.
• Automatizace a využití AI pro optimalizaci gradientních parametrů v reálném čase.
• Rozšíření na další biologické látky, jako jsou rekombinantní proteiny či bispecifické protilátky.

Závěr

Nově vyvinuté BioResolve CX pH koncentráty ve spojení s BioResolve SCX mAb kolony představují robustní, reprodukovatelnou a vysoce rozlišenou platformu pro analýzu nabitých variant mAbs. Metoda kombinuje univerzální pH gradientní eluci, rychlou analýzu, dlouhodobou stabilitu a jednoduchou implementaci v kvalitativních a kvantitativních laboratořích.

Reference

1. Fekete S, Beck A, Veuthey JL, Guillarme D. Ion-exchange chromatography for the characterization of biopharmaceuticals. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2015;113:43–55.
2. Zhang L, Patapoff T, Farnan D, Zhang B. Improving pH gradient cation-exchange chromatography of monoclonal antibodies by controlling ionic strength. J Chromatogr A. 2013;1272:56–64.
3. Lin S, Pohl CA. Buffer kit and method of generating a linear pH gradient. US patent US8921113 B2; 2014.
4. Goyon A, et al. Determination of isoelectric points and relative charge variants of 23 therapeutic monoclonal antibodies. J Chromatogr B. 2017;1065–1066:119–128.
5. Kroner F, Hubbuch J. Systematic generation of buffer systems for pH gradient ion exchange chromatography and their application. J Chromatogr A. 2013;1285:78–87.
6. Lauber MA, et al. Designing a New Particle Technology for Robust Charge Variant Analysis of mAbs. Waters Application Note 720006475EN; 2019.
7. Yang H, Warren B, Koza SM. Development of Monoclonal Antibody Charge Variant Analysis Methods Using Waters BioResolve SCX mAb Column. Waters Application Note 720006477EN; 2019.