Optimizing LC-MS Separations of mAbs using a BioResolve SCX mAb Column and IonHance CX-MS pH Concentrates

Význam tématu

Monoklonální protilátky vykazují mikroheterogenitu v podobě deamidace glykování truncace C-terminálního lysinu či oxidace což může ovlivnit jejich účinnost a bezpečnost. Analýza variací náboje je klíčová pro kontrolu kvality biotherapeutik a zajištění konzistence léčiv.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vyvinout a optimalizovat iontově výměnnou chromatografii spojenou s hmotnostní spektrometrií (IEX-MS) pro analýzu variací náboje monoklonálních protilátek. Studie představuje použití BioResolve SCX mAb kolony ve spojení s IonHance CX-MS pH koncentráty pro přímou identifikaci nabíjených variant.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky (NIST mAb trastuzumab adalimumab) byly štěpeny IdeS enzymem a následně analyzovány LC-MS podmínkami:

• ACQUITY UPLC I-Class PLUS
• BioResolve SCX mAb kolona 2.1 × 50 mm 3 µm
• IonHance CX-MS pH koncentráty 10× ředění (50 mM pH 5.0 a 160 mM pH 8.5)
• Gradient 2–98 % B za 21 min při průtoku 0.1 mL/min
• Detektor ACQUITY RDa MS ESI+ m/z 400–7000
• Data zpracována v UNIFI Scientific Information System

Hlavní výsledky a diskuse

IonHance CX-MS koncentráty poskytují stabilní pH a bakteristatickou ochranu. Lineární pH gradient v rozsahu elučních podmínek pro mAb byl potvrzen. Experimenty SEC-MS ukázaly výraznější vliv pH na ionizační efektivitu než zvýšení ionic strength. Metoda dosahuje reprodukovatelnosti retencí <2 % RSD i při rozdílných šaržích kolon a koncentrátů. Úprava ředění (10× až 50×) a tvaru gradientu umožňuje optimalizovat oddělení hlavní formy a nízkopodílových variant (+1K +2K deamidace).

Přínosy a praktické využití metody

Metoda zkracuje čas přípravy frakcí umožňuje přímé hyfenování IEX-MS a poskytuje vysokou selektivitu a citlivost při analýze intact i subjednotek protilátek. Přináší robustní a reprodukovatelné výsledky vhodné pro QA/QC procesy.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření na další biotherapeutika integrace s 2D LC technikami zvýšení throughputu v automatizovaných systémech a využití superchargingu nových detektorů. Důležitá je dále softwarová podpora a multivarinační analýza dat pro komplexní charakterizaci heterogenity.

Závěr

Použití BioResolve SCX mAb kolony a IonHance CX-MS pH koncentrátů poskytuje rychlou a spolehlivou metodu IEX-MS pro analýzu variací náboje monoklonálních protilátek. Metodu lze flexibilně přizpůsobit změnou ionic strength a gradientu pro cílené oddělení jednotlivých variant.

Reference

1. Fekete S Beck A Fekete J Guillarme D Method Development for the Separation of Monoclonal Antibody Charge Variants in Cation Exchange Chromatography Part I Salt Gradient Approach J Pharm Biomed Anal 2015 102 33–44
2. Stoll DR Pass the Salt Evolution of Coupling Ion-Exchange Separations and Mass Spectrometry 2019
3. Khawli LA Goswami S Hutchinson R Kwong ZW Yang J Wang X Yao Z Sreedhara A Cano T Tesar DB Nijem I Allison DE Wong PY Kao YH Quan C Joshi A Harris RJ Motchnik P Charge Variants in IgG1 mAbs 2010 2 6 613–624
4. Stoll DR Harmes DC Danforth J Wagner E Guillarme D Fekete S Beck A Direct Identification of Rituximab Main Isoforms and Subunit Analysis by Online Selective Comprehensive Two-Dimensional Liquid Chromatography–Mass Spectrometry Anal Chem 2015 87 16 8307–8315
5. Sorensen M Harmes DC Stoll DR Staples GO Fekete S Guillarme D Beck A Comparison of Originator and Biosimilar Therapeutic Monoclonal Antibodies Using Comprehensive Two-Dimensional Liquid Chromatography Coupled with Time-of-Flight Mass Spectrometry mAbs 2016 8 7 1224–1234
6. Füssl F Cook K Scheffler K Bones J Charge Variant Analysis of Monoclonal Antibodies Using Direct Coupled pH Gradient Cation Exchange Chromatography to High-Resolution Native Mass Spectrometry Anal Chem 2018 90 7 4669–4676
7. Leblanc Y Ramon C Bihoreau N Chevreux G Charge Variants Characterization of a Monoclonal Antibody by Ion Exchange Chromatography Coupled On-Line to Native Mass Spectrometry Case Study After a Long-Term Storage at +5 °C J Chromatogr B Anal Technol Biomed Life Sci 2017 1048 130–139
8. Sankaran PK Kabadi PG Honnappa CG Subbarao M Pai HV Adhikary L Palanivelu DV Identification and Quantification of Product-Related Quality Attributes in BioTherapeutic Monoclonal Antibody via a Simple And Robust Cation-Exchange HPLC Method Compatible with Direct Online Detection of UV and Native ESI-QToF-MS Analysis J Chromatogr B Anal Technol Biomed Life Sci 2018 1102–1103 83–95
9. Konermann L Addressing a Common Misconception Ammonium Acetate as Neutral pH Buffer for Native Electrospray Mass Spectrometry J Am Soc Mass Spectrom 2017 28 9 1827–1835
10. Hedges JB Vahidi S Yue X Konermann L Effects of Ammonium Bicarbonate on the Electrospray Mass Spectra of Proteins Evidence For Bubble-Induced Unfolding Anal Chem 2013 85 13 6469–6476
11. Bailey AO Han G Phung W Gazis P Sutton J Josephs JL Sandoval W Charge Variant Native Mass Spectrometry Benefits Mass Precision and Dynamic Range of Monoclonal Antibody Intact Mass Analysis mAbs 2018 10 8 1214–1225
12. Yan Y Liu AP Wang S Daly TJ Li N Ultrasensitive Characterization of Charge Heterogeneity of Therapeutic Monoclonal Antibodies Using Strong Cation Exchange Chromatography Coupled to Native Mass Spectrometry Anal Chem 2018 90 21 13013–13020
13. Fussl F Trappe A Cook K Scheffler K Fitzgerald O Bones J Comprehensive Characterisation of the Heterogeneity of Adalimumab via Charge Variant Analysis Hyphenated Online to Native High Resolution Orbitrap Mass Spectrometry mAbs 2019 11 1 116–128
14. Cassou CA Sterling HJ Susa AC Williams ER Electrothermal Supercharging in Mass Spectrometry and Tandem Mass Spectrometry of Native Proteins Anal Chem 2013 85 1 138–146
15. Sterling HJ Cassou CA Susa AC Williams ER Electrothermal Supercharging of Proteins in Native Electrospray Ionization Anal Chem 2012 84 8 3795–3801
16. Muneeruddin K Nazzaro M Kaltashov IA Characterization of Intact Protein Conjugates and Biopharmaceuticals Using Ion-Exchange Chromatography with Online Detection by Native Electrospray Ionization Mass Spectrometry and Top-Down Tandem Mass Spectrometry Anal Chem 2015 87 19 10138–10145
17. Farjami A Siahi-Shadbad M Akbarzadehlaleh P Molavi O Development and Validation of Salt Gradient CEX Chromatography Method for Charge Variants Separation and Quantitative Analysis of the IgG mAb-Cetuximab Chromatographia 2018 81 12 1649–1660
18. Fekete S Beck A Fekete J Guillarme D Method Development for the Separation of Monoclonal Antibody Charge Variants in Cation Exchange Chromatography Part II Ph Gradient Approach J Pharm Biomed Anal 2015 102 282–289
19. Farsang E Murisier A Horvath K Beck A Kormany R Guillarme D Fekete S Tuning Selectivity in Cation-Exchange Chromatography Applied for Monoclonal Antibody Separations Part 1 Alternative Mobile Phases and Fine Tuning of the Separation J Pharm Biomed Anal 2019 168 138–147
20. Zhang L Patapoff T Farnan D Zhang B Improving pH Gradient Cation-Exchange Chromatography of Monoclonal Antibodies by Controlling Ionic Strength J Chromatogr A 2013 1272 56–64