HILIC/MS METHOD FOR THE QUANTIFICATION OF THE POLAR BIOMARKER ITACONIC ACID

Význam tématu

Itakonová kyselina je malá polární mastná kyselina, která se ve zdravotnickém výzkumu uplatňuje jako biomarker pro včasnou detekci stavů jako gestacionální diabetes mellitus či revmatoidní artritida.
Rychlá a spolehlivá kvantifikace tohoto analyta v krevním séru umožňuje včasnou lékařskou intervenci a zlepšení péče o pacienty.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo vyvinout a ověřit HILIC-MS metodu pro spolehlivou a citlivou kvantifikaci itakonové kyseliny v lidském séru bez nutnosti derivatizace.
Studie detailně popisuje optimalizaci destičkové extrakce, precipitace proteinů a chromatografických podmínek s cílem dosáhnout vysoké selektivity, obnovitelnosti a citlivosti.

Použitá metodika a instrumentace

Chromatografie:

• Typ kolony: amide HILIC, 100×2,1 mm, sub-2 µm částice
• Mobilní fáze: >80 % acetonitril s 5 mM acetátem amonným pH 9,0
• Režim: gradientní HILIC, neg. iontové ESI

Hromadění a čištění vzorku:

• 200 µl séra precipitováno 0,1 % TFA (1:1)
• PASS-THROUGH SPE na Oasis WCX µElution destičce
• Vortex, centrifugace 4000 rpm/15 min a přímá injekce

Detekce:

• UHPLC Waters ACQUITY H-Class
• Tandemový kvadrupól Xevo TQ-XS
• MRM přechody pro itakonovou kyselinu (ESO-) s optimalizovanými kanály

Hlavní výsledky a diskuse

Lineární rozsah metody byl 2,5–500 ng/mL s výbornou korelací (r2=0,9971) a přesností v rozmezí 88,7–110,8 %.
Limit kvantifikace (LLOQ) dosahoval ~1 ng/mL, dostatečně pod přirozenými koncentracemi 5,2–260 ng/mL.
Optimalizace precipitace a SPE s WCX sorbentem poskytla průměrnou obnovu kolem 94 % a minimální matrix efekty.
Výběr 0,1 % TFA zajistil nejlepší kompromis mezi citlivostí a obnovou sloučeniny.

Přínosy a praktické využití metody

Vyvinutá HILIC-MS metoda nevyžaduje derivatizaci, zkracuje přípravu vzorku a eliminuje náročné ion-pair LC postupy.
Vysoká selektivita a citlivost umožňují spolehlivou detekci endogenní itakonové kyseliny v klinickém prostředí.
Metoda je vhodná pro rutinní QA/QC laboratoře i výzkumné aplikace zaměřené na metabolomiku.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Optimalizace doby chromatografické analýzy pro vyšší propustnost
• Úprava přípravy vzorku pro omezení pozadí a interferencí
• Zařazení stabilních izotopově značených interních standardů pro zvýšení robustnosti
• Vývoj alternativních MRM přechodů pro snížení interferencí od přirozených látek

Závěr

Studie prokázala, že HILIC-MS založená na amide kolonu a triple-quad detekci umožňuje rychlou, přesnou a citlivou kvantifikaci itakonové kyseliny v lidském séru bez nutnosti derivatizace.
Metoda splňuje požadavky klinické praxe i výzkumných laboratoří díky nízkému LLOQ, vynikající linearitě a výborné obnovitelnosti.

Reference

• Alpert A.J. J. Chromatogr. 499 (1990) 177–196.
• Michopoulos F., Whalley N., Theodoridis G., Wilson I.D., Dunkley T.P.J., Critchlow S. Targeted profiling of polar intracellular metabolites using ion-pair HPLC-UHPLC-MS: applications to serum, urine and tissue extracts.