Bioanalytical LC-MS Quantification of Itaconic Acid: A Potential Metabolic Biomarker of Inflammation

Význam tématu

Itakonová kyselina je dicarboxylová molekula odvodená ze sukcinátu zapojená do trikarboxylového metabolického cyklu. Její úroveň v plazmě se při zánětlivých stavech může výrazně zvýšit, což ji činí perspektivním biomarkerem pro onemocnění související s infekcí a zánětem, jako jsou sepse, revmatoidní artritida či gestační diabetes mellitus.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout robustní bioanalytickou metodu pro kvantifikaci itakonové kyseliny v lidské plazmě s vysokou citlivostí a přesností. Metoda kombinuje rychlou pasážovou přípravu vzorku se selektivním odstraněním fosfolipidů, reverzní fázovou chromatografii a tandemovou kvadrupólovou hmotnostní spektrometrii.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky plazmy (200 μl) se zpracovaly pomocí Ostro™ 96jádrové destičky pro srážení proteinů a odstraňování fosfolipidů. Chromatografická separace probíhala na systému ACQUITY UPLC I-Class s kolonkou HSS T3 (2.1×100 mm, 1.8 μm) při 50 °C, tok 0,6 ml/min a gradientu formolakton v acetonitrilu. Detekce byla zajištěna tandemovým hmotovým spektrometrem Xevo TQ-XS v režimu ESI- a víceúrovňového sledování přechodů (MRM). Interní standard tvořil izotopově značený C13 C5,d4 itakonát.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosahuje dolní kvantifikační meze 0,5 ng/ml s lineární dynamikou 0,5–100 ng/ml (r2>0,999). Rekonstituce a diluce vzorku poskytují ostré a stabilní píky s rozlišením isomeru akonační kyseliny. Obnovení analyzované látky přesahovalo 85 % a matrice efekt pod 5 %. Odstranění fosfolipidů dosáhlo více než 95 %, což minimalizuje jejich hromadění v systému a zvyšuje životnost přístroje. Mezní hodnoty přesnosti a opakovatelnosti odpovídají bioanalytickým doporučením (CV < 15 %).

Přínosy a praktické využití metody

Navržená metoda umožňuje rychlé a spolehlivé stanovení itakonové kyseliny v klinických a farmaceutických laboratořích. Díky automatizované přípravě ve 96jádrovém formátu a nízkému objemu vzorku je vhodná pro vysoce propustné aplikace a screening většího počtu vzorků.

Budoucí trendy a možnosti využití

Dalším krokem může být rozšíření metodiky na multiplexní kvantifikaci dalších metabolitů TCA cyklu, integrace s vysokopropustnými platformami pro komplexní metabolomické studie a aplikace v personalizované medicíně pro sledování zánětlivých biomarkerů.

Závěr

Studie demonstruje vysoce citlivou, precizní a robustní LC-MS/MS metodu pro kvantifikaci itakonové kyseliny v lidské plazmě. Kombinace pasážové přípravy s efektivním odstraněním fosfolipidů a reverzní chromatografií zajišťuje dlouhodobou stabilitu a reprodukovatelnost analýzy.

Reference

• U S National Library of Medicine Itaconic Acid PubChem Compound Summary 2019
• Michelucci A Hiller K Cordes T et al Itaconic Acid The Surprising Role of an Industrial Compound as a Mammalian Antimicrobial Metabolite Annual Review of Nutrition 2015 35(1) 451-473
• Meiser J Kraemer L Jaeger C et al Itaconic Acid Indicates Cellular but Not Systemic Immune System Activation Oncotarget 2018 9(63) 32098-32107
• Michopoulos F Karagianni N Whalley NM et al Targeted Metabolic Profiling of the Tg197 Mouse Model Reveals Itaconic Acid as a Marker of Rheumatoid Arthritis Journal of Proteome Research 2016 15(12) 4579-4590
• de Seymour J Conlon C Sulek K et al Early Pregnancy Metabolite Profiling Discovers a Potential Biomarker for the Subsequent Development of Gestational Diabetes Mellitus Acta Diabetologica 2014 51 887