NATIVE MASS SPECTROMETRY DISTINGUISHES HOMO VS HETERO NON-COVALENT DIMERIC AGGREGATES OF MONOCLONAL ANTIBODIES

Význam tématu

Analýza agregátů monoklonálních protilátek je klíčová pro zajištění jejich stability, biologické aktivity a bezpečnosti terapeutických přípravků. Nekovalentní dimery, trimery i vyšší uskupení mohou ovlivnit rozpustnost, imunitní odpověď a kvalitu finálního produktu. Native mass spectrometry (MS) poskytuje detailní molekulární hmotnostní informace za zachování původních nekovalentních interakcí, což doplňuje běžné techniky velikostní exkluze chromatografie (SEC).

Cíle a přehled studie / článku

Studie si kladla za cíl vyvinout a ověřit metodu založenou na off-line spojení preparativní SEC s native nano-ESI-MS pro rozlišení homodimerů (AA, BB) a heterodimerů (AB) vyrobených ze stresovaných vzorků dvou terapeutických mAb (označených mAb1 a mAb4). Výsledky porovnává s monomerními frakcemi a hodnotí možné artefakty vznikající při ionizaci.

Použitá metodika a instrumentace

Postup přípravy vzorků:

• Výměna formulátových pufrů (Trastuzumab 20 mg/mL, NIST mAb 10 mg/mL) do 100 mM amonného acetátu pH 6,5 pomocí kolonek Bio-Spin P6.
• Preparativní SEC-UV frakcionace pro obohacení monomeru a HMW (high-molecular-weight) agregátů.
• Analytická SEC-MALS pro ověření čistoty a stanovení poměru monomer:HMW ve frakcích.

Tandem ESI-MS na přístroji Waters Synapt G2-Si QTof:

• NanoESI zdroj, kovové kapiláry, objem vzorku 5 µL.
• Sada parametrů: napětí rozprašovače 1,5 kV; kuželové napětí 150 V; Ar tok v trap buňce 7 mL/min; kolizní energie v trapu 30 V a transferu 10 V; teplota zdroje pokojová.
• Skeny 2 s na rozsahu m/z 3 000–20 000; dekonvoluce spekter pomocí algoritmu MaxEnt1.

Hlavní výsledky a diskuse

Native nano-ESI-MS prokázala:

• Detekci monomerů, poloviny molekul (half-mAb), dimerů, trimerů a tetramerů při zachování nekovalentních interakcí.
• Odlišení homodimerů mAb1:mAb1 a mAb4:mAb4 od heterodimerů mAb1:mAb4 ve frakci izolované přípravnou SEC.
• Absenci artefaktů dimerní tvorby během ESI-MS, což potvrdila opakovaná experimentální série.
• Shodu hmotností stanovených dekonvolucí s teoretickými hodnotami dle individuálních monomerů.

Analytická SEC-MALS poskytla suplementární potvrzení složení frakcí a jejich čistoty.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje:

• Robustní charakterizaci nekovalentních agregátů mAb ve vývoji i při QA/QC výrobních procesů.
• Kvantifikaci a rozlišení různých typů dimerových uskupení bez chemické modifikace.
• Rychlé zjištění stability a skloubení mAb v různých formulacích a podmínkách skladování.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávaný vývoj zahrnuje:

• Integraci ion mobility (IM-MS) pro detailní topologii agregátů.
• Automatizaci off-line spojení SEC-MS i v GMP prostředí.
• Využití vyšší rozlišovací schopnosti Q-ToF a Orbitrap přístrojů pro přesnější mapování vazebných rozhraní.
• Rozšíření aplikace na další biologické makromolekuly a komplexní bioterapeutika (fúzní proteiny, ADC).

Závěr

Studie prokázala, že kombinace preparativní SEC a native nano-ESI-MS na platformě Synapt G2-Si je účinným nástrojem pro rozlišení a charakterizaci homodimerů a heterodimerů monoklonálních protilátek. Metoda poskytuje spolehlivé molekulární hmotnostní informace a odhaluje přítomnost nekovalentních agregátů bez tvorby artefaktů, což je klíčové pro vývoj a kontrolu kvality bioterapeutik.

Reference

1. Doneanu C., Wei H., Ludwig R., Hoffman L., Tao L., Yu Y.Q., Chen W. Native mass spectrometry distinguishes homo vs hetero non-covalent dimeric aggregates of monoclonal antibodies. Waters Corporation, 2019.