T he Analysis of Multimeric Monoclonal Antibody Aggregates by Size-Exclusion UPLC

Význam tématu

Monoklonální protilátky (mAb) představují klíčovou třídu bioterapeutik, u které je kritické sledování jak úrovně, tak i typu agregace. Solubilní agregáty mohou vést k nežádoucím imunitním reakcím nebo poklesu stability a účinnosti léčiva.

Cíle a přehled studie

Studie hodnotí výkon nové UPLC kolony BEH450 (450 Å, 2,5 µm) ve srovnání s konvenční SEC-HPLC pro separaci vysoce molekulárních forem (dimer až 1,8 MDa) a dále zkoumá sériové zapojení BEH450 a BEH200 (200 Å, 1,7 µm) SEC kolon pro komplexní profilaci mAb agregátů.

Použitá metodika a instrumentace

Analýzy probíhaly na systému ACQUITY UPLC H-Class Bio s detektorem UV (280/214 nm) a MALS (Wyatt miniDAWN TREOS). Mobilní fáze: 5 mM fosfát sodný a 250 mM NaCl, pH 6,8. Kolony:

• BEH450 SEC, 2,5 µm, 4,6×150/300 mm
• BEH200 SEC, 1,7 µm, 4,6×150/300 mm

Pro srovnání byla použita také HPLC kolona (silika 8 µm, 450 Å). Data zpracováno v Empower 3, UNIFI a Wyatt Astra software. Pro přípravu kovalentních agregátů mAb byl použit cross-linker BS3.

Hlavní výsledky a diskuse

BEH450 UPLC SEC poskytla výrazně lepší rozlišení a citlivost pro IgM pentamer vs. dipentamer ve srovnání s HPLC SEC (peak height +50 %). Sériové zapojení BEH200+BEH450 rozšířilo měřitelný rozsah od 10 kDa do 1,8 MDa, zlepšilo oddělení thyroglobulinu a dimeru a zvýšilo rozlišení nízkomolekulárních forem (IgG vs. BSA). Při analýze křížově vázaného mAb vzorku a stresového freeze-thaw modelu ukázalo sériové uspořádání výhodu v separaci trimeru, tetrameru a vyšších multimerů, zatímco BEH200 samostatně lépe rozeznal fragmenty vzniklé štěpením.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká rozlišovací schopnost a citlivost pro vícemolekulární agregáty
• Rozšířený rozsah molekulových hmotností až do 1,8 MDa
• Rychlá analýza s nízkou spotřebou vzorku
• Možná integrace s MALS pro přesnou charakterizaci agregátů

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj může směřovat k integraci SEC-UPLC s pokročilými detektory (např. viskozimetrie, refraktometrie) a hromadnou automatizaci pro vysokoprůchodové profilování stability bioterapeutik. Sériová kombinace různých porézních materiálů by mohla nabízet cílené doladění rozsahu měřených agregátů.

Závěr

ACQUITY UPLC BEH450 a BEH200 SEC kolony poskytují robustní, vysoce výkonné řešení pro analýzu dimerních a multimerických agregátů mAb. Sériové zapojení obou materiálů rozšiřuje užitečný rozsah analýzy a umožňuje detailní sledování distribuce agregátů, což je klíčové pro hodnocení kvality a bezpečnosti bioterapeutik.

Reference

1. Cromwell ME, Hilario E, Jacobson F. Protein aggregation and bioprocessing. AAPS J. 2006;8:E572-9.
2. Rosenberg AS. Effects of protein aggregates: an immunologic perspective. The AAPS Journal. 2006;8:501-7.
3. Koza S, Fountain KJ. Advances in Size Exclusion Chromatography for the Analysis of Macromolecular Proteins. Waters Application Note 720004618EN. 2013 February.
4. Hong P, Koza S, Fountain KJ. Analysis of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled with Mass Spectrometry Under Non-Denaturing Conditions. Waters Application Note 720004254EN. 2012 March.