Agilent Biocolumns - Aggregate/Fragment Analysis - Application Compendium

Význam tématu

V oblasti biotechnologické výroby a kontroly kvality bioterapeutik je klíčové přesně identifikovat a kvantifikovat agregáty, fragm​enty a varianty proteinů. Proteinová agregace může ovlivnit účinnost, stabilitu a bezpečnost léčivých proteinů, zejména monoklonálních protilátek (mAb), fúzních proteinů, insulinů, cytokinů a dalších malých i velkých biologických makromolekul. Agilent Biocolumns nabízí speciálně navržené stacionární fáze pro vysokorozlišovací, spolehlivou a reprodukovatelnou analýzu těchto proteinů pomocí kapalinové chromatografie.

Cíle a přehled článku

Následující shrnutí popisuje ucelený přístup k analýze agregátů a fragmentů proteinů v různých aplikacích:

• Popisuje agendové příručky a aplikační poznámky Agilent pro různé biomolekuly
• Ukazuje metody oddělování a kvantifikace agregátů, dimerů a monomerů pomocí size exclusion chromatografie (SEC)
• Prezentuje optimalizaci mobilní fáze včetně pH, iontové síly a přídavku organických modifikátorů
• Představuje použití různých detektorů: UV/DAD, refrakční index (RI), statické a dynamické rozptyl světla (LS/DLS) a mass spectrometry (MS)

Použitá metodika a instrumentace

Agilent 1260 Infinity II Bio-inert Quaternary LC systém se speciálně upraveným průtokem a výkonem pro agresivní biologické pufry, kombinovaný s kolonkami AdvanceBio SEC (130–300 Å, 1.9–2.7 µm) a Bio SEC-3/Bio SEC-5 (100–2000 Å), umožňuje:

• Isokratické separace v rozsahu 150 mM fosfátových kapalin či širokém solném gradientu
• Rychlé screeningy metodového vývoje pomocí Agilent Buffer Advisor pro automatické směšování mobilní fáze
• Přepínání detektorů UV (210–280 nm), DAD, RI i LS/DLS pro simultánní kvantitativní a molekulární charakterizaci
• Připojení k mass spectrometru pro natívní i denaturační SEC-MS

Hlavní výsledky a diskuse

Metodové studie ukázaly:

• Vysoce reprodukovatelné oddělení monomeru, dimeru a vyšších agregátů mAb a dalších proteinů s rozlišením Rs > 2 na krátkých (150 mm) i dlouhých (300 mm) kolonkách
• Vliv mobilní fáze – optimalizace pH a síly solí (fosfát vs. PBS) na tvar špiček, pnutí a retenci proteinů
• Informace z LS/DLS detekce pro odhalení sub-mikronových agregátů i přes malou koncentraci
• Nativní SEC-MS metody pro stanovení přesné molární hmotnosti a rozlišení proteinových variant či konjugátů
• Rychlé a spolehlivé screeningy až 20–40 podmínek za den díky modernímu LC systému

Přínosy a praktické využití metody

Agilent Biocolumns umožňují laboratorní praxi:

• Rychlé uvádění nových proteinových léčiv do výzkumu a výroby
• Detailní kontrolu kvality a stability proteinů během vývoje, formulace a skladování
• Optimalizaci separačních podmínek přímo v analyzátoru bez manuálních příprav vysoce koncentrovaných pufrů
• Kompletní kontrolu procesu – od kontroly monomeru až po velké subviditelné částice

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje:

• Integrace víceúrovňové chromatografie (SEC–HIC–IEX) pro multidimenzionální profiling
• Umělé inteligence a strojové učení pro predikci optimálních metodových podmínek
• Automatizace a vysokopropustné platformy pro screening stohlavých sad vzorků
• Pokročilá natívní LC-MS a ion-mobility detekce pro globální proteomické charakterizace

Závěr

Portfolio Agilent Biocolumns pokrývá široké spektrum biomolekul od malých peptidů až po velké biologické komplexní proteiny a ADCs. Kombinace vysoce inertních kolonek AdvanceBio SEC, Bio SEC a moderních detekčních systémů (UV, LS, RI, MS) v bio-inertním LC systému zajišťuje rychlou, reprodukovatelnou a vysoce citlivou analýzu agregátů a fragmentů proteinů, nezbytnou pro výzkum a zajištění kvality bioterapeutik.

Reference

• Bayol A. et al., Pharmeuropa Bio, 2004.
• Librizzi F., Rischel C., Protein Science, 2005.
• Kondaveeti S. et al., Agilent Application Notes.