An Efficient Workflow for Identification and Monitoring of Host Cell Proteins During Monoclonal Antibody Bioprocessing

Význam tématu

Analýza a kontrola hostitelských proteinů (HCP) při výrobě monoklonálních protilátek je nezbytná pro zajištění kvality, bezpečnosti a účinnosti biopatentingových produktů. LC‐MS workflow nabízí širší dynamický rozsah a proteomický přístup než tradiční ELISA, umožňuje komplexní screening a kvantifikaci HCP napříč celým procesem purifikace.

Cíle a přehled studie

Studie popisuje dvoufázový LC‐MS přístup k identifikaci a monitoringu HCP v CHO buněčných liniích při purifikaci monoklonálních protilátek:

• Discovery HCP Assay – data‐independent MSE akvizice s 90min peptidovými separacemi pro komplexní identifikaci HCP.
• Monitoring HCP Assay – rychlejší MSE akvizice s 30min gradientem pro kvantitativní sledování vybraných HCP peptidů.

Použitá metodika a instrumentace

Sample preparation:

• Digestion mAb (NIST mAb) s Lys‐C a trypsinem, denaturace RapiGestem, redukce DTT, alkylace IAM pro odstranění nestráveného papr.
• Spike-in MassPREP standardy (ADH, PHO, BSA) pro kalibraci a určení hranice detekce.

LC‐MS platforma:

• LC: Waters ACQUITY UPLC I‐Class Plus s CSH C18 column (2.1×150 mm, 1.7 µm), dvoufázové eluce (0–45 % ACN ve 90 min, 0–45 % ve 30 min), teplota 60 °C.
• MS: Xevo G2‐XS QTof se softwarovým řízením UNIFI 1.9.4, data‐independent MSE akvizice (nízká a vysoká energie), rozsah 100–2000 Da.
• Data processing: Progenesis QI for proteomics 4.0, vyhledávání proti databázím myš, CHO a sestavení spectral library pro monitoring.

Hlavní výsledky a diskuse

Discovery assay umožnil identifikaci tří spikovaných standardů a šesti endogenních HCP s detekčním limitem 5 ppm. Monitoring assay demonstroval kvantitativní sledování dvou nízkoabundantních HCP peptidů napříč pěti purifikačními protokoly (Protein A eluát, čtyři SCX protokoly A–D). Protokol D vykázal nejnižší rozpětí (ppm) a nejlepší konzistenci vv. peptidů.

Přínosy a praktické využití metody

Workflow poskytuje rychlou, robustní a citlivou metodu pro kontinuální kontrolu HCP během výrobních fází monoklonálních protilátek. Díky jednoduché 1D LC‐MS konfiguraci lze metodu snadno integrovat do rutinního QA/QC a bioprocesního výzkumu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření na různé typy biologik (rekombinantní proteiny, vakcíny).
• Integrace pokročilých datově nezávislých akvizičních režimů (DIA) a umělé inteligence pro automatizované vyhodnocení spektrálních knihoven.
• Zvýšení throughputu skrze kratší chromatografické běhy a multiplexní analýzy.

Závěr

Navržený dvoufázový LC‐MS workflow s MSE akvizicí a robustním softwarem pro analýzu umožňuje efektivní identifikaci a kvantifikaci HCP v bioprocesu monoklonálních protilátek a nabízí snadnou implementaci do průmyslové praxe.

Reference

1. Doneanu C. et al. Analytical Chemistry, 2015, 87, 10283.
2. Huang Y. Q. et al. Analytical Chemistry, 2017, 89, 5436.