A Comprehensive Approach for HCP Identification, Quantification, and Monitoring Based on a Single Dimension (1D) LC Separation

Význam tématu

Residualní hostitelské proteiny (HCP) jsou nízkoúrovňové nečistoty (1–100 ppm) v proteinových biofarmacích, které mohou vyvolat nežádoucí imunitní reakce, snížit stabilitu nebo účinnost léčiva a proto jsou regulátory přísně vyžadovány k identifikaci a kvantifikaci před schválením.

Cíle a přehled studie

Studie představuje jednotný dvoufázový postup pro objevnou identifikaci a kvantifikaci HCP v monoklonálních protilátkách na základě jednorozměrné LC separace a datově nezávislé akvizice SONAR, následované rutinní monitorovací fází využívající MS^E režim.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorky: NIST mAb LRM 8670 rozpuštěná, denaturovaná RapiGest SF, redukovaná DTT, alkylovaná IAM, digesce Lys-C/trypsinem.
• LC: ACQUITY UPLC I-Class se CSH C18 kolonkou, gradient 90 min (sonar) a 30 min (MS^E).
• MS: Xevo G2-XS QTof, akvizice SONAR (skanující kvadrupól) a MS^E (nízká/vysoká energie).
• Software: MassLynx 4.1, Progenesis QI for Proteomics 4.0.

Hlavní výsledky a diskuse

• SONAR akvizice snižuje spektrální komplexitu, umožňuje identifikaci nízkopříjmových HCP (10–30 ppm), zejména beta-2-mikroglobulinu a nízkopříjmového Fc-receptoru.
• Vytvořena knihovna 24 peptidových MS/MS spekter pro zvýšení konfidence vyhledávání.
• V monitorovací fázi MS^E byl zvolen panel standardů (ADH, BSA, PHO, CLP-B) spikovaných v různých hladinách; metoda prokázala kvantifikaci s RSD pod 10 % až do ~20 ppm.

Přínosy a praktické využití metody

• Jednorozměrná LC bez frakcionace zkracuje dobu analýzy při zachování vysokého rozlišení.
• Workflow umožňuje přechod od objevné identifikace k rutinnímu monitoringu HCP během vývoje a validace výrobního procesu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s iontovou mobilitou pro další redukci rušivých signálů a zvýšení selektivity.
• Automatizace tvorby a sdílení spektrálních knihoven pro rozšíření pokrytí HCP v různých buněčných systémech.
• Začlenění metody do standardních QA/QC protokolů v regulovaných biofarmaceutických laboratořích.

Závěr

Metoda založená na SONAR a jednorozměrné LC-MS představuje citlivý, selektivní a opakovatelný přístup k identifikaci a kvantifikaci HCP v biotherapeutikách, kompatibilní s rutinními QA/QC procesy.

Reference

1. Doneanu CE et al. Anal Chem 2015, 87, 10283–10291.
2. Huang L et al. Anal Chem 2017, 89, 5436–5444.
3. Chen W et al. ACS Symposium Series 2015, 357–393.
4. Gethings LA et al. Rapid Commun Mass Spectrom 2017, 31, 1599–1606.
5. Moseley MA et al. J Proteome Res 2018, 17, 770–779.
6. Silva JC et al. Mol Cell Proteomics 2006, 5, 144–156.