DATA INDEPENDENT LC-MS ASSAYS FOR IDENTIFICATION, QUANTIFICATION AND MONITORING OF HOST CELL PROTEINS IN MONOCLONAL ANTIBODIES

Význam tématu

Hostitelské proteiny (HCP) představují významný rizikový faktor v biotechnologické výrobě monoklonálních protilátek (mAb). Jejich přesná detekce a kvantifikace na úrovni jednotek ppm je nezbytná pro zajištění kvality, bezpečnosti a regulační shody finálních léčiv.

Cíle a přehled studie

Studie popisuje vývoj a validaci dvou datově nezávislých LC-MS workflow pro analýzu HCP v digestech mAb:

• HCP Discovery Assay – identifikace HCP pomocí MSE akvizice na vysokorozlišujícím QTof přístroji.
• HCP Monitoring Assay – rychlá, shodná citlivost (LLOQ 5 ppm) v datově kompatibilním prostředí pro QC analýzy.

Použitá metodika a instrumentace

• Příprava vzorku: precipitace mAb, enzymatická digesce s RapiZyme trypsinem, redukce DTT a okyselení formiátovou kyselinou.
• LC podmínky Discovery Assay: UPLC ACQUITY Premier CSH C18 kolona 2,1×150 mm, 90min gradient (0–45 % acetonitrilu), 0,2 mL/min, 60 °C.
• LC podmínky Monitoring Assay: stejný systém, 30min gradient.
• MS akvizice Discovery: Xevo G3 QTof, MSE mód, rozmezí 400–2000 Da, low-energy CE 6 V, high-energy ramp 15–45 V.
• MS akvizice Monitoring: BioAccord LC-MS, MSE mód, rozmezí 50–2000 Da, low-energy cv 40 V, high-energy ramp 60–80 V.
• Datové zpracování Discovery: Progenesis QI 4.2, Protein Metrics Byonic 5.2.31, Hi3 kvantifikace.
• Datové zpracování Monitoring: waters_connect Accurate Mass Screening, integrace 43 vybraných peptidů, Hi3 kvantifikace.

Hlavní výsledky a diskuse

• Discovery workflow detekoval 7 endogenních HCP a 2 spiked proteiny (ADH, PHO) v NIST mAb digestu s detekčním limitem 5 ppm.
• Monitoring workflow dosáhl stejného LLOQ 5 ppm pro 4 spiked proteiny (ADH, BSA, ENL, PHO) i v přítomnosti komplexního mAb matrix.
• Obě metody vykázaly vhodnou přesnost (RSD < 15 %) a linearitu v rozsahu 5–150 ppm.
• Chromatografický výkon CSH Premier kolony zůstal stabilní i při vysokém přetížení vzorkem.

Přínosy a praktické využití metody

• Data-independent MSE akvizice umožňuje komplexní screening i bez předchozího výběru prekurzorů.
• Monitoring Assay v prostředí waters_connect je plně kompatibilní s GMP/GLP a vhodný pro QC laboratoře biotechnologických společností.
• Metody poskytují rychlou odezvu (30–90 min) a schopnost sledovat nízké úrovně HCP ve výrobních procesech.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace cílených akvizičních režimů (PRM/SRM) pro ještě vyšší citlivost a selektivitu.
• Automatizace přípravy vzorků s minimálním ztrátovým procesem.
• Rozšíření HCP knihoven o nové hostitelské typové proteiny pro různá expresní systémy.
• Využití pokročilých AI-nástrojů pro rychlou interpretaci dat a prediktivní údržbu chromatografických systémů.

Závěr

Vyvinuté Discovery a Monitoring LC-MS workflow přinášejí robustní, citlivé a kompatibilní řešení pro identifikaci a kvantifikaci HCP v monoklonálních protilátkách. Obě metody dosahují LLOQ 5 ppm, podporují regulované prostředí a nabízejí rychlou analytickou odezvu vhodnou pro výzkum i průmyslové aplikace.

Reference

1. Doneanu CE, Anderson M, Williams BJ, Lauber MA, Chakraborty A, Chen W. Anal Chem. 2015;87:10283–10291.
2. Huang L, Wang N, Mitchell CE, Brownlee T, Maple SR, De Felippis MR. Anal Chem. 2017;89:5436–5444.
3. Chen IH, Xiao H, Daly T, Ning L. Anal Chem. 2020;92:3751–3757.
4. Wang Q, Slaney TR, Wu W, Ludwig R, Tao L, Leone A. Anal Chem. 2020;92:10327–10335.
5. Yang F, Li D, Kufer R, Cadang L, Zhang J, Dai L, et al. Anal Chem. 2021;93:723–731.
6. Ippoliti S, Zampa N, Yu YQ, Lauber MA. Waters application note 2023;P/N 720007840.
7. Silva JC, Gorenstein MV, Li GZ, Vissers JP, Geromanos SJ. Mol Cell Proteomics. 2006;5:144–156.