Identifying Monoclonal Antibody Mutation Sites Using the Agilent 1290 Infinity II 2D-LC Solution with Q-TOF LC/MS

Význam tématu

Monoklonální protilátky představují klíčovou třídu biofarmak při léčbě řady onemocnění. S rostoucím počtem biosimilárních verzí originálních mAb je nezbytné přesně porovnat jejich strukturu a čistotu. Dvourozměrná kapalinová chromatografie (2D-LC) spojená s vysokým rozlišením hmotnostní spektrometrie (Q-TOF) nabízí vynikající schopnost odhalit i drobné aminokyselinové mutace či glykosylační varianty.

Cíle a přehled studie / článku

Studie se zaměřuje na srovnání originátoru infliximabu (Remicade) a jeho kandidátního biosimiláru pomocí Agilent 1290 Infinity II 2D-LC v kombinaci s Q-TOF LC/MS. Cílem bylo identifikovat případné rozdíly v primární sekvenci, zejména v rámci těžkého řetězce, a demonstrovat přínos 1D a 2D peptide mappingu v hodnocení podobnosti biopreparátů.

Použitá metodika a instrumentace

Analytický postup zahrnoval:

• Redukci disulfidických můstků DTT a alkylaci IAA
• Trypsinovou štěpnou digestii po navázání Rapigest surfaktantu
• 1D RPLC-UV-MS analýzu těžkých a lehkých řetězců na AdvanceBio RP-mAb C4
• 2D-LC peptide mapping: kombinace SCX×RPLC a RPLC×RPLC

Instrumentace:

• Agilent 1290 Infinity II High Speed Pump, Multisampler, Multicolumn Thermostat, Diode Array Detector
• Agilent 6530/6540 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS s Agilent Jet Stream ionizací
• Agilent InfinityLab Quick Change Valve Drive pro 2D-LC se dvěma 40µL smyčkami
• Software: Agilent OpenLab CDS ChemStation s 2D-LC add-on, MassHunter pro kontrolu a analýzu dat, GC Image LC×LC Edition

Hlavní výsledky a diskuse

1D LC/MS středně upřesněná analýza odkryla u biosimiláru těžkého řetězce nárůst hmotnosti o 99 Da proti originátoru, což vysvětlovalo i změnu retenční doby. Následný LC×LC peptide mapping odhalil dvě klíčové bodové mutace: v C-terminu řetězce zaměnu lysinu za isoleucin (+113 Da) a ve vnitřní sekvenci záměnu threoninu za serin (–14 Da). Kombinovaný efekt vedl k pozorovanému +99 Da posunu. Výsledky byly potvrzeny MS/MS fragmentací a RT-PCR s následným sekvenováním DNA z CHO klonů.

Přínosy a praktické využití metody

2D-LC hyphenované k Q-TOF MS umožňuje detailní mapování mAb tryptických peptidů s vysokou chromatografickou kapacitou a analytickou selektivitou. Metoda je ideální pro:

• Porovnávací hodnocení biosimilárů proti originátorům
• Detekci drobných mutací či posttranslačních úprav
• Kontrolu kvality ve výrobě a QC laboratořích

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se širší adopce komplexních 2D-LC režimů (např. HILIC×RPLC) pro detailní charakterizaci bioterapeutik. Integrace umělé inteligence a pokročilých algoritmů pro analýzu 2D-LC/MS dat může dále zrychlit a zpřesnit identifikaci kritických rozdílů. Vyšší automatizace přípravy vzorků a pokročilé moduly multiplexních analýz podpoří robustnost a průchodnost.

Závěr

Agilent 1290 Infinity II 2D-LC v kombinaci s Q-TOF LC/MS prokázala schopnost spolehlivě odhalit a charakterizovat bodové mutace v těžkém řetězci infliximabu. Tento přístup představuje klíčový nástroj pro ověřování podobnosti biosimilárů, zajištění konzistence výroby a splnění regulatorních požadavků.