Automated Switching between Peptide and Glycan Mapping with the Agilent 1290 Infinity II LC System

Význam tématu

Monoklonální protilátky představují významnou skupinu biologických léčiv s vysokou strukturální komplexitou. Glykan mapping a peptid mapping patří mezi klíčové analytické přístupy pro úplné charakterizování sekvence a glykosylace léčivé bílkoviny. Kombinované nasazení těchto metod umožňuje kontrolu kvality, porovnání originátorů a biosimilárních produktů a dodržování regulatorních požadavků.

Cíle a přehled studie

Cílem aplikace bylo demonstrovat možnost automatického přepínání mezi oddělenou analýzou N-glykanů a tvorbou peptidového mapování ve stejném chromatografickém běhu bez manuálního zásahu. Ukázalo se, že Agilent 1290 Infinity II LC systém vybavený přepínacím ventilem, FLD, DAD a Q-TOF MS umožňuje vysoce reprodukovatelná data pro řadu vzorků mAb v jediné analytické sekvenci.

Použitá metodika a instrumentace

Chromatografické uspořádání sestávalo z vysokotlaké pumpy, vícenásobného vzorkovače, multikolónového termostatu s přepínacím ventilem, diodového a fluorescenčního detektoru a Q-TOF hmotnostního spektrometru s ESI. Pro glykan mapping byla použita HILIC kolona AdvanceBio Glycan Mapping (2.1 × 150 mm, 2.7 μm) ve spojení s InstantPC chemickou sadou pro rychlou deglykosylaci a značení. Pro peptid mapping se uplatnila reverzní Faza AdvanceBio Peptide Plus (2.1 × 150 mm, 2.7 μm). Vzorky prošly jednoduchou přípravou: enzymatické uvolnění a označení glykans, tryptické trávení, redukce, alkylace a desalting.

Hlavní výsledky a diskuse

Glykan mapping přinesl vysoce rozlišené HILIC-FLD a HILIC-MS chromatogramy s nízkou RSD (pod 1,5 %) pro retenční časy i plochy píků. U modelové InstantPC CHO N-glykanové knihovny se podařilo rozlišit izomery a získat čisté MS spektra. Při porovnání trastuzumabu originátoru a biosimilárních klonů odhalilo měřené profily rozdíl v poměru G0F/G1F. Peptid mapping poskytl sekvenční pokrytí přes 98,5 % a přesnou kvantifikaci PTM jako deamidace, oxidace, pyroglutamát, C-terminální modifikace a glykozylace.

Přínosy a praktické využití metody

• Jednotný analytický běh umožňuje šetřit čas a minimalizovat lidskou práci
• Kombinovaná FLD, DAD a MS detekce nabízí vysokou selektivitu a citlivost
• Vysoká reprodukovatelnost usnadňuje porovnání originátorů a biosimilárů
• Rychlá chemická příprava glykanů zkracuje celkový workflow na hodiny místo dnů

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další automatizace přípravy vzorků a multi-parametrická kontrola kvality
• Integrace s pokročilými softwarovými nástroji pro de novo sekvenování a glykobioinformatiku
• Vysokopropustné platformy pro screenování velkého množství klonů a formulací
• Možnost rozšíření na O-glykany, glykozaminoglykany a další posttranslační modifikace

Závěr

Automatické přepínání mezi glykan a peptid mappingem na jednom LC-MS systému přináší vysokou flexibilitu, produktivitu a spolehlivost v charakterizaci mAb. Představená aplikace potvrzuje, že jediná analytická sekvence postačuje pro komplexní profilaci sekvence i glykosylace a je vhodná pro vývoj i kontrolu kvality biologických léčiv.

Reference

1. Sandra K Vandenheede I Sandra P Modern chromatographic and mass spectrometric techniques for protein biopharmaceutical characterization Journal of Chromatography A 2014 1335 81 103
2. Fekete S et al Chromatographic electrophoretic and mass spectrometric methods for the analytical characterization of protein biopharmaceuticals Analytical Chemistry 2016 88(1) 480 507
3. Beck A et al Characterization of therapeutic antibodies and related products Analytical Chemistry 2013 85(2) 715 736
4. D’Atri V et al Hydrophilic interaction chromatography for the characterization of therapeutic monoclonal antibodies at protein peptide and glycan levels LC-GC Europe 2017 30(8) 424 434
5. Guile G R et al A rapid high resolution high performance liquid chromatographic method for separating glycan mixtures and analyzing oligosaccharide profiles Analytical Biochemistry 1996 240(2) 210 226
6. Martosella J et al A novel HILIC column for high speed N-glycan analysis Agilent application note 5991-4886EN 2017
7. Yan J Jones A Streamlined workflows for N-glycan analysis of biotherapeutics using Agilent AdvanceBio Gly-X InstantPC and 2-AB Express sample preparation with LC FLD MS Agilent application note 5994-1348EN 2019