Simultaneous Analysis of Amino Acids, Acylcarnitines, and Succinylacetone in Dried Blood Spots for Research Using Nonderivatized and Derivatized Methods

Význam tématu

Analýza aminokyselin, acylkarnitinů a succinylacetonu v usušených kapkách krve je klíčová pro výzkum vrozených poruch metabolismu.
Flow injection-tandem hmotnostní spektrometrie (FIA-MS/MS) umožňuje rychlé a multiplexní stanovení bez potřeby chromatografické separace.
Porovnání derivatizace a nonderivatizace zkoumá kompromis mezi citlivostí a jednoduchostí přípravy vzorku.

Cíle a přehled studie

Vyvinout a validovat metodu FIA-MS/MS pro simultánní kvantifikaci 12 aminokyselin, 18 acylkarnitinů a succinylacetonu (SUAC) v DBS.
Srovnat klasickou derivatizaci butanolovými estery s přímým (nonderivatizovaným) extrakčním postupem.
Všechna měření proběhla na triplekvadruple TSQ Endura v režimu Selected Reaction Monitoring (SRM).

Použitá instrumentace

• Hmotnostní spektrometr Thermo Scientific TSQ Endura (triple kvadruple) s HESI ionizací
• Dionex UltiMate HPG-3200 RS pumpa a UltiMate WPS-3000 TRS autosampler
• Flow injection analysis (žádná chromatografická kolona, plynulý průtok
• Software iRC PRO pro automatizované postanalytické výpočty

Použitá metodika

Jednostupňová extrakce DBS a přidání izotopově značených interních standardů pro aminokyseliny, acylkarnitiny a SUAC.
Derivatizace: butanolová esterifikace s HCl při 65 °C pro zvýšení ionizační efektivity.
Nonderivatizace: extrakce methanolem, odpaření a rehydratace v acetonitril–vodní směsi s kyselinou formovou.
Detekce: SRM s optimalizovanými hodnotami kolizní energie a RF lens pro každý analyt a standard.

Hlavní výsledky a diskuse

Intra-série přesnost pod 10 % a mezi-série pod 15 % u obou přístupů pro aminokyseliny, SUAC a acylkarnitiny.
Průměrná metodická odchylka mezi derivatizací a nonderivatizací byla 3–5 % u aminokyselin a SUAC, 10–15 % u acylkarnitinů.
SRM zachovalo vysoký signál i pro špatně ionizující látky (např. SUAC, C5DC) bez ohledu na derivatizaci.

Přínosy a praktické využití metody

• Krátký doba analýzy 1,5 minuty na vzorek
• Snížení režijních nákladů díky eliminaci separační kolony a jednodušší přípravě
• Vysoká citlivost a selektivita SRM vhodná i pro nízkokoncentrované metabolity
• Automatizované výpočty s iRC PRO minimalizují manuální chyby a zkracují dobu postanalýzy

Budoucí trendy a možnosti využití

Další zvýšení citlivosti a rozšíření spektra monitorovaných metabolit.
Integrace mikrofluidních a robotizovaných systémů pro zpracování DBS na vysoké propustnosti.
Využití strojového učení a analýzy velkých dat k automatizaci interpretace výsledků.

Závěr

Vyvinuté FIA-MS/MS metody umožňují spolehlivou simultánní analýzu aminokyselin, acylkarnitinů a succinylacetonu z jednoho extraktu DBS.
Nonderivatizovaný postup nabízí srovnatelnou přesnost a robustnost vůči derivatizaci při zjednodušené přípravě.
TSQ Endura ve spojení s režimem SRM představuje robustní platformu pro výzkum i screening vrozených metabolických poruch.

Reference

• Chace D.H., Kalas T.A., Naylor E.W. Clin. Chem. 2003, 49(11):1797–1817.
• Chace D.H. et al. Clin. Chem. 1993, 39(1):66–71.
• Millington D.S. et al. J. Inherit. Metab. Dis. 1990, 13(3):321–324.
• Dhillon K.S. et al. Clin. Chim. Acta 2011, 412(11–12):873–879.
• De Jesus V.R. et al. Clin. Chim. Acta 2010, 411(9–10):684–689.